DNA糖基化酶1對幽門螺桿菌致胃上皮細胞DNA損傷的保護作用

王 　媛，鄧小飛*

（1. 安順市人民醫院消化內科，貴州　安順　561000；2. 第三軍醫大學新橋醫院急診科，重慶 　400037）

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染是慢性胃炎、胃潰瘍、甚至胃癌的關鍵危險因素[1]。炎癥、活性氧(reactive oxygen species，ROS)及DNA損傷在HP感染后胃組織從胃炎向胃癌演變過程中發揮了重要的作用[2]。HP感染產生的低水平ROS，在感染初期，并不會直接導致DNA鏈斷裂，而是導致DNA堿基氧化性損傷，其中，8羥基脫氧鳥嘌呤(8 h ydroxy d eoxyguanine，8-OHdG)是主要損傷形式[3]。堿基切除修復是DNA堿基損傷的主要修復方式，8-OHdG DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)是堿基切除修復過程的限速酶，識別并修復損傷的堿基，防止基因組不穩定和基因突變[4]。研究表明，胃腫瘤組織的OGG1表達顯著低于正常胃組織[5]，并且，OGG1基因多態性與人群胃癌易感性呈顯著正相關[6]，提示OGG1可能在胃癌發生發展過程中扮演了重要的角色。因此，本研究通過RNA干擾技術沉默OGG1表達，通過檢測細胞活力和細胞凋亡及PARP表達等，探討OGG1在HP感染致胃上皮細胞(GES-1) DNA損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1　細胞培養與分組處理

人胃黏膜上皮細胞株GES-1和H.pylori ACTC43504(CagA+，VacA+)標準菌株由貴州省安順市人民醫院提供。細胞培養采用DMEM培養基(Invitrogen公司)添加10%胎牛血清(Hyclone公司)和100 U/mL的青霉素-鏈霉素雙抗(Sigma公司)，于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中，傳代接種于6孔板或96孔板經培養達對數生長期，在HP感染前，細胞更換不含抗生素的培養基。感染時，將HP接種于含有10%無菌脫脂羊血的空腸彎曲桿菌培養基(西寶生物)中，于37 ℃、N2體積分數為85%、CO2體積分數為10%、O2體積分數為5%的培養箱中培養3 d，刮取HP至含有1.5 mL DMEM培養基的EP管中，4 ℃、12 000 g離心10 min，去上清，經分光光度計檢測波長為660 nm時的細菌吸光度D(660)值。實驗分組為4組：對照組、干擾組(OGG1 siRNA)、HP感染組、OGG1干擾+HP感染組。在HP(病毒滴度10∶1)感染GES-1細胞24或48 h后檢測。

1.2　OGG1 siRNA轉染

轉染試劑采用脂質體2000(Invitrogen公司)，采用OptiMEM(Invitrogen公司)配制脂質體和siRNA(100 nmol/L)的工作液。于HP感染前12 h，將干擾組細胞轉染OGG1特異的siRNA(Invitrogen公司)，正義鏈為5′-GC UUGAUGAUGUCACUUAUTT-3′，反義鏈為5′-AUAAG UGACAUCAUCAAGCTG-3′；對照組細胞轉染對照序列正義鏈為5′-GUACUUCCA GCUAGAUGUUUU -3′，反義鏈為5′-AACAUCUAGCUGGAAGUACUU-3′，OGG1干擾效率采用Western blot檢測干擾24 h后OGG1蛋白表達。

1.3　細胞活力檢測

采用細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(Dojindo公司)檢測細胞增殖活力。根據試劑盒說明書，將GES-1細胞接種于96孔板，接種密度為5×105/mL，培養至對數生長期，經siRNA轉染和HP感染處理完畢，每孔加入含10% CCK-8原液的DMEM 100 μL繼續培養2 h，分別于HP感染后24和48 h后檢測細胞活力。每組設3個復孔。

1.4　細胞毒性檢測

采用細胞毒性檢測試劑盒(Roche公司)檢測細胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放。各組細胞同1.3處理完畢后，根據試劑盒說明書，分別收集HP感染24和48 h后的細胞上清并加入LDH溶液在25 ℃反應30 min。采用Infinite M200(TECAN公司)讀取各孔的D(450)值，每組設置3個復孔，測量值采用對照組標準化百分率表示。

1.5　彗星試驗檢測DNA損傷

采用彗星試驗試劑盒(Trevigen公司)檢測經HP感染48 h后的細胞DNA損傷情況。用胰酶消化、重懸各組GES-1細胞，調整密度至(3～5)×105/mL，與0.65%的低熔點瓊脂糖凝膠按1∶10(V/V)混勻并平鋪于Trevigen彗星試驗專用載玻片上，4 ℃預冷30 min后，將載玻片置于裂解液(2.5 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris HCl，100 mmol/L EDTA，10%二甲亞砜和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，pH 10.0)，4 ℃裂解2 h，后置于堿性解旋液(200 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH＞13)，室溫解旋30 min。隨后將載玻片置于水平電泳槽，以1 V/cm電泳40 min。電泳完畢后，用去離子水清洗載玻片2次，75%乙醇脫水5 min，4 ℃干燥后，SYBR Green I(Invitrogen)染色液，避光染色25 min，熒光顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。所獲圖片采用CASP軟件分析，每組至少分析100個細胞，采用尾長(tail length，TL)、尾部DNA含量、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM) 和 尾矩(tail moment，TM)評價DNA損傷程度。

1.6　免疫熒光檢測γH2AX焦點形成

采用免疫熒光法檢測經HP感染48 h后的γH2AX焦點形成。用多聚賴氨酸包被蓋玻片并放置于24孔板，GES-1細胞按5×105/mL接種，培養至對數生長期時轉染OGG1 siRNA，24 h后實施HP感染，于感染后48 h將貼有細胞的蓋玻片用4%甲醛室溫固定15 min，采用0.1% Triton X-100 在4 ℃透膜15 min，熒光封閉液(碧云天公司)封閉30 min后，加入γH2AX(Abcam，1∶200)，4 ℃過夜，次日，加入相應的Alexa Fluor?647熒光二抗(Invitrogen，1∶100)，37 ℃反應1 h，洗片后，采用DAPI(碧云天公司)反染細胞核，共聚焦顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。

1.7　細胞凋亡檢測

采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測各組細胞經HP感染48 h后的凋亡情況。細胞處理同1.5。根據TUNEL試劑盒(Roche公司)說明書，細胞接種貼片后，將貼有細胞的蓋玻片用4%甲醛室溫固定15 min，0.3%的H2O2室溫處理10 min以抑制內源性的過氧化物酶，采用0.1% Triton X-100在4 ℃條件下透膜15 min，隨后，每個樣本滴加50 μL TUNEL反應液37 ℃避光反應1 h，熒光顯微鏡(Leica公司)觀察并照相。每組至少記錄500個細胞，凋亡指數為總細胞中TUNEL陽性細胞的比例。

1.8　Western blot檢測

采用Western blot檢測經HP感染24 h后OGG1蛋白表達及感染48 h后的γH2AX和PARP蛋白表達。GES-1細胞按5×105/mL接種于6孔板，培養至對數生長期時轉染OGG1 siRNA，24 h后實施HP感染，于感染后48 h刮取細胞并加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Roche公司)的RIPA裂解液(碧云天公司)冰上裂解30 min，15 000 g離心20 min，取上清，采用BCA試劑盒(碧云天公司)測定蛋白濃度，60 μg蛋白上樣10% SDS-PAGE電泳，蛋白分離后，經過轉膜，封閉，而后加入兔抗人OGG1單克隆抗體(Abcam，1∶1 000)、羊抗人γH2AX單克隆抗體(Abcam，1∶1 000)、羊抗人PARP 多克隆抗 體 (Abcam， 1∶ 1 000)及 鼠 抗 人 β-actin (Sigma-Aldrich，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日洗膜，37 ℃辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，采用增強的化學發光系統(Amersham公司)檢測蛋白表達。

1.9　統計學方法

應用SPSS 13.0軟件錄入各組數據，采用單因素方差分析統計各組數-據，用Student’s t檢驗分析兩組間的差異，數據采用x±s表示，每組實驗至少重復3次，以α=0.05為檢驗水準。

2　結　果

2.1　OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細胞活力變化和LDH釋放的影響

圖1　OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細胞活力變化和LDH釋放的影響

GES-1細胞轉染OGG1 siRNA或者對照siRNA序列后，再感染HP，分別于感染后24 h和48 h檢測細胞活力和LDH釋放。如圖1所示。Western blot檢測顯示干擾組OGG1蛋白表達較對照組顯著降低(p＜0.01)(圖1A和B)。與對照組相比，單純HP感染和單純OGG1干擾細胞活力及LDH釋放均無明顯影響。而在OGG1干擾+HP感染24和48 h后，與對照組和單純HP感染組相比，OGG1干擾+HP感染組細胞活力顯著下降，LDH釋放顯著增多(p＜0.05或p＜0.01)。

2.2　OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細胞DNA 損傷的影響

彗星實驗結果表明，OGG1干擾后，細胞DNA在HP感染后24 h和48 h發生拖尾現象(圖2A～D和I～L)。經CASP軟件分析后，與對照組及HP感染組比較，OGG1干擾+HP感染24 h后尾長、尾部DNA含量和Olive尾矩顯著增加(p＜0.05或p＜0.01)(圖2F和G)，而尾矩差異無統計學意義(P＞0.05)(圖2H)；而在OGG1干擾+HP感染48 h后，與對照組及HP感染組比較，尾長、尾部DNA含量、Olive尾矩均顯著增加(p＜0.01)，尾矩也顯著增加(p＜0.05)(圖2F和G)。與對照組比較，單純HP感染組和單純OGG1感染組細胞的尾長、尾部DNA含量、Olive尾矩及尾矩在感染后的24 h和48 h均無顯著變化(P＞0.05)。

2.3　OGG1沉默聯合HP感染引起胃上皮細胞DNA雙鏈斷裂

圖2　OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細胞DNA損傷的影響

γH2AX是DNA雙鏈斷裂的分子標志物，與對照組比較，單純HP感染組和單純OGG1感染組細胞核內γH2AX焦點無明顯變化，而HP感染+OGG1干擾組細胞核γH2AX焦點明顯增多(圖3A)，而采用Western blot檢測發現，與對照組比較，HP感染+OGG1干擾組γH2AX蛋白表達顯著升高(p＜0.01)(圖3B和C)。

圖3　OGG1干擾對HP感染引起的胃上皮細胞γH2AX焦點形成及蛋白表達的影響

2.4　OGG1干擾對HP感染引起細胞凋亡的影響

HP感染48 h后，與對照組比較，單純HP感染組和單純OGG1感染組TUNEL陽性細胞及活化的PARP無明顯變化，HP感染+OGG1干擾組細胞核TUNEL陽性細胞明顯增多(圖4A)。而采用Western blot檢測發現，與對照組比較，HP感染+OGG1干擾組活化的PARP蛋白表達水平顯著升高，差異具有統計學意義(p＜0.01)(圖4B和C)。

3　討論

本研究通過RNA干擾技術沉默OGG1表達，評估了細胞活力、細胞凋亡和細胞死亡；并采用彗星實驗和γH2AX焦點形成檢測細胞DNA損傷，我們發現HP感染在胃上皮細胞OGG1表達下調的情況下，導致顯著的細胞DNA損傷和細胞凋亡，在細胞水平解釋了人群OGG1多態性和表達下調與胃癌發生相關關系的分子機制。

研究表明，HP感染引起細胞氧化應激，主要通過兩條經典途徑：一是通過PI3K/Rac1信號通路激活NADPH氧化酶1(NOX1)產生ROS[7]，二是通過精胺氧化酶在多胺精胺向精胺轉化的過程中產生過氧化氫，細胞氧化應激進而引起氧化性DNA損傷[3]。由于OGG1是氧化性DNA堿基損傷修復途徑的關鍵酶，因此本研究發現的HP感染引起OGG1下調的胃上皮細胞DNA損傷和細胞凋亡主要是氧化應激介導的。既往研究表明，HP感染(病毒滴度為50∶1)引起胃上皮細胞氧化應激水平增高和ATM/ATR依賴的DNA損傷[8]，而本研究采用更低劑量的HP感染(病毒滴度為10∶1)未引起DNA損傷，而在OGG1沉默的情況下出現DNA損傷效應，表明OGG1在HP感染致胃上皮細胞DNA損傷過程中發揮了保護作用。

HP感染產生的氧自由基攻擊細胞DNA，首先引起具有潛在致癌特性的8-OHdG形成，此種DNA損傷類型主要由OGG1介導的堿基切除修復途徑完成，從而防止基因突變，維持基因組DNA完整性[9]。OGG1介導的氧化性DNA損傷修復不完全或失敗將導致DNA鏈斷裂、細胞周期阻滯、細胞凋亡以及線粒體功能障礙，進而加劇ROS產生[10]。研究表明，OGG1沉默引起氧化性DNA損傷加重、DNA鏈斷裂和細胞凋亡，提示OGG1對細胞DNA具有保護作用[11]。這與本研究的結論是一致的。

DNA損傷在各類癌癥發生發展過程中關鍵作用已經得到廣泛的認同。而OGG1因為參與氧化性DNA損傷修復，與癌癥發生發展有著密切的聯系。人群研究提示，OGG1基因多態性與胃癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤發生密切相關[12-15]，OGG1在多種腫瘤組織中OGG1表達下降[4]，OGG1敲除小鼠致癌模型中發生肺癌的數量和大小較對照組顯著增多，發生時間明顯提前[16]。新近研究發現，OGG1過表達的轉基因小鼠在誘導乳腺癌模型中，腫瘤的體積較對照明顯減小，轉移率顯著減低，同時伴隨著氧化應激水平降低，DNA損傷減輕和線粒體功能改善，表明OGG1介導的氧化性DNA損傷修復限制了腫瘤的發生和轉移[17]。我們發現較低劑量的HP感染未引起胃上皮細胞DNA損傷和凋亡，然而OGG1沉默后，HP感染導致了細胞DNA損傷，同時伴隨著細胞凋亡增加，細胞活力下降，表明OGG1保護了HP感染致胃上皮細胞DNA損傷。綜合前面的分析，OGG1可能是HP感染致胃癌發生的早期關鍵分子，這為防護HP感染導致的胃癌發生提供了新的理論依據和干預靶點。

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