鄰苯二甲酸二辛酯亞慢性暴露對SD大鼠血細胞的影響

任雪丹 李　諾呂中明 * 王民生*

（1．東南大學公共衛生學院，江蘇　南京　210009；2．江蘇省疾病預防控制中心，江蘇　南京 　210009）

鄰苯二甲酸二辛酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是鄰苯二甲酸酯類(phthalates acid esters，PAEs)的重要成員，也是近代全球使用最為廣泛的塑料增塑劑之一，被認為是廣泛的環境持久性有機污染物(persistent organic pollutants，POPs)。DEHP主要用于生產柔性聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)塑料，賦予聚氯乙烯塑料柔韌性，可以占軟PVC的40%。由于其實用性和成本效益，DEHP被廣泛用于消費產品，包括玩具、個人護理產品、化妝品、農藥、涂料、印染、室內裝修材料、藥品和食品包裝材料[1-4]。由于DEHP與塑料基質之間是以不牢固的氫鍵和范德華力連接，所以伴隨使用時間的推移，DEHP不斷地從塑料中逸出，揮發至大氣、土壤、水域中，造成環境介質、生物、食品等的污染。眾多研究表明，DEHP是重要的環境內分泌干擾物，具有雄性、雌性生殖內分泌毒性、肝腎毒性、神經毒性和遺傳毒性等多種生物毒性，并帶來生物血液和生化方面的改變[5-11]。本研究擬通過對大鼠進行不同劑量的DEHP喂飼染毒，用ADVIA2120i型全自動五分類血細胞分析儀測定各組大鼠血液中白細胞、紅細胞和血小板等生理指標的變化，以期研究DEHP亞慢性暴露對大鼠血細胞的影響。

1　材料與方法

1.1　主要試劑與儀器

DEHP(純度≥99.5%，美國Sigma公司)、一次性塑料培養皿(美國Corning 公司)、1.5 mL EP管(美國Corning公司)；ADVIA2120i型全自動五分類血細胞分析儀(德國Siemens公司)

1.2　動物飼養與分組

1.2.1動物的分組 健康清潔級SD大鼠100只，雌雄各半，體質量為70～90 g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(京) 2012-0001，質量合格證號11400700158173。在適應性飼養3 d后，將受試大鼠按體質量隨機分為5組，即對照組(飼喂基礎飼料)、4個DEHP染毒組(染毒劑量分別為5、50、500和2 500 mg/kg)，每組20只，雌雄各半，單籠飼養。

1.2.2動物的飼養 大鼠飼養于屏障環境動物實驗室中，實驗動物環境使用許可證號SYXK(蘇)2012-0037。動物實驗室溫度控制在20～26 ℃，濕度為40%～70%。各劑量組按相應比例將DEHP均勻拌入飼料中，將飼料以平均每日動物體質量8%的攝食量按組別給予大鼠，連續飼喂染毒90 d。染毒期間，大鼠可自由飲水、攝食。

1.3　指標與方法

1.3.1體質量及食物利用率 觀察并記錄大鼠在飼養期間的一般情況(如日常行為表現、中毒和死亡情況等)；于每周稱量記錄體質量、攝食量，并計算總的食物利用率(總食物利用率=總增質量/總攝食質量×100%)。

1.3.2血細胞參數測定方法 90 d喂養結束后，大鼠空腹16 h稱量并記錄最終空腹體質量，用滴加EDTA抗凝劑的1.5 mL EP管分別取雌雄大鼠全血1.0 mL，應用全自動血細胞分析儀立即進行血細胞分析。檢測白細胞總數(WBC)、中性粒細胞(NEUT)、嗜酸性粒細胞(EOS)、嗜堿性粒細胞(BASO)、單核細胞(MONO)、淋巴細胞(LYM)、紅細胞總數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、直接測定的血紅蛋白濃度(CHCM)、血紅蛋白含量分布寬度(HDW)、血小板總數(PLT)、平均血小板體積(MPV)和未染色的大細胞數量(LUC)以及其相應的百分比等指標。

1.5　統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，多組間均數比較經方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，各實驗組與對照組用Dunnett’s法比較；組間率的比較采用非參數檢驗。所有結果用 表示，以α=0.05為檢驗水準。

2　結果

2.1　DEHP對大鼠體質量的影響

在染毒期間，對照組經觀察均未出現異常現象；與對照組比較，DEHP 5、50和500 mg/kg劑量組均未觀察到明顯的差異；而2 500 mg/kg DEHP染毒組動物則均表現出精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛(頭頸部和四肢以及腹部)等中毒體征，攝食量減少，大鼠體質量在染毒后顯著下降，差異有統計學意義(p＜0.05)，見表1。

表1　不同劑量DEHP染毒對大鼠體質量的影響(g，-，n=10)

表1　不同劑量DEHP染毒對大鼠體質量的影響(g，-，n=10)

與對照組相比，*p＜0.05.

分組(mg/kg) 雄性 雌性染毒前 染毒后 染毒前 染毒后對照組 78.7±4.1 552.0±23.7 77.7±5.0 312.1±33.9 DEHP 5 78.9±3.6 554.0±39.1 78.5±3.9 327.7±30.7 50 77.9±3.4 544.3±35.2 79.1±5.3 344.7±27.3 500 79.3±2.9 551.2±23.9 79.6±5.3 321.4±39.3 2 500 79.5±4.6 408.1±18.8* 79.9±5.9 273.8±13.6*

2.2　不同染毒劑量DEHP對大鼠食物利用率的影響

在DEHP染毒期間，5、50和500 mg/kg劑量組的體質量和攝食量與對照組相比差異均無統計學意義(P＞0.05)，而2 500 mg/kg劑量組的大鼠體質量和攝食量與對照組相比明顯下降，且差異具有統計學意義(p＜0.05)。見表2。

表2　不同劑量DEHP染毒對大鼠食物利用率的影響(-x±s，n=10)

2.3　DEHP對大鼠白細胞的影響

見表3。結果表明，2 500 mg/kg組雄性大鼠嗜酸性粒細胞(EOS)顯著減少，雌性大鼠白細胞總數(WBC)顯著降低，與對照組相比差異均具有統計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。在500和2 500 mg/kg劑量下，雌性大鼠淋巴細胞(LYM)與對照組相比顯著增加，差異有統計學意義(p＜0.05)。

表3　不同劑量DEHP染毒對大鼠白細胞相關指標的影響(-x±s，n=10)

2.4　DEHP對大鼠紅細胞的影響

如表4所示。由表4可見，在雄性大鼠中，2 500 mg/kg DEHP染毒組紅細胞總數(RBC)、血紅蛋白(HGB)和紅細胞壓積(HCT)與對照組相比顯著下降，差異均具有統計學意義(p＜0.01)。

在雌性大鼠中，DEHP 500 mg/kg和2 500 mg/kg組血紅蛋白(HGB)顯著下降，與對照組相比，差異有統計學意義(p＜0.05)。平均血紅蛋白含量(MCH)隨著劑量的增加而降低，呈現出劑量-效應關系，在500 mg/kg和2 500 mg/kg劑量下與對照組相比顯著下降，差異均有統計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。在2 500 mg/kg劑量下，平均血紅蛋白濃度(MCHC)和直接測定的血紅蛋白濃度(CHCM)與對照組相比顯著下降，差異均有統計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。

表4　不同劑量DEHP染毒對大鼠紅細胞相關指標的影響(-x±s，n=10)

2.5　不同染毒劑量DEHP對大鼠血小板的影響

見表5。在DEHP染毒期間，未發現其對大鼠血小板各項指標產生影響。

表5　不同劑量DEHP染毒對大鼠血小板相關指標的影響(，n=10)

表5　不同劑量DEHP染毒對大鼠血小板相關指標的影響(，n=10)

平均血小板體積/fL分組(mg/kg)平均血小板體積/fL雄性 雌性血小板總數 血小板總數(×10/μL)3(×10/μL)3對照組 900.6±157.9 7.53±0.78 933.0±121.8 7.23±0.47 DEHP 5 1 008.7±133.5 6.82±0.82 973.8±114.3 6.96±0.45 50 1 042.7±55.1 7.71±0.57 908.6±136.8 6.98±0.48 500 955.6±205.1 7.02±0.41 985.4±94.1 7.13±0.36 2 500 864.0±153.4 8.26±0.91 1 034.2±106.2 7.92±0.60

3　討論

從DEHP亞慢性染毒對大鼠體質量、增質量、總攝食量及食物利用率的影響結果來看，隨著染毒劑量的增加，DEHP 2 500 mg/kg組大鼠的體質量、體質量的增量、總攝食量與對照組相比顯著下降，提示，DEHP亞慢性暴露對大鼠的體質量和攝食量有一定的影響。

白細胞是血液細胞的一種，通常也被稱為免疫細胞，在機體內更新的速度比較快。作為免疫系統的一部分，具有防御和免疫功能，參與對細菌、病毒等異物入侵時的免疫過程，白細胞各項指標的變化是機體免疫力變化的標志[12]。在DEHP 500 mg/kg劑量下，雌性大鼠淋巴細胞(LYM)與對照組相比顯著增加(p＜0.05)，2 500 mg/kg劑量時，淋巴細胞(LYM)持續增加(p＜0.05)，白細胞總數(WBC)顯著降低，與對照組相比差異具有統計學意義(p＜0.05)，說明高劑量的DEHP可能影響機體的免疫系統功能，對免疫細胞產生細胞毒性并破壞白細胞。這也和有關DEHP在高濃度下，可使自由基產生增加，影響機體的抗氧化酶系和引起氧化損傷，從而產生細胞毒性的報道結果相一致[13]。研究[14-16]表明，DEHP具有“佐劑”的作用，能增強免疫原性的活力、誘發哮喘、誘導巨噬細胞分化和分泌促炎性因子，加重炎癥過敏反應。

紅細胞負責供給全身組織和細胞所需的O2，帶走其產生的部分CO2，對機體的正常運行具有重要作用。紅細胞總數(RBC)、血紅蛋白(HGB)和紅細胞壓積(HCT)主要用來判斷有無貧血及貧血的程度，較為常見的是3者降低即為貧血，根據HGB降低程度劃分貧血程度[17]。由本研究結果可見，在雄性大鼠中，2 500 mg/kg組紅細胞總數(RBC)、血紅蛋白(HGB)和紅細胞壓積(HCT) 與對照組相比顯著下降，差異有統計學意義(p＜0.01)。說明2 500 mg/kg劑量下，DEHP可對大鼠的紅細胞產生一定的影響。平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)和直接測定的血紅蛋白濃度(CHCM)均為紅細胞的平均值，據此可進行貧血的形態學分類[18]。在雌性大鼠中，平均血紅蛋白含量(MCH)隨著劑量的增加而降低，在500 mg/kg和2 500 mg/kg劑量下與對照組相比顯著下降(p＜0.05或p＜0.01)。同時，平均血紅蛋白濃度(MCHC)和直接測定的血紅蛋白濃度(CHCM) 在2 500 mg/kg劑量下與對照組相比顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，說明機體發生了嚴重貧血，血紅蛋白含量顯著下降，從而攜帶O2和CO2的能力也顯著降低。

血小板的功能主要是促進止血和加速凝血，以及維護毛細血管壁完整性。在本實驗中，不同劑量的DEHP對大鼠血小板的指標無顯著影響。說明在本實驗中，DEHP對大鼠的凝血止血功能無顯著影響。

綜上所述，一定劑量的DEHP會對實驗性大鼠的體質量、攝食量和血液系統產生影響。

[1] PFE V D M，DEVINE D V. Alternatives in blood operations when choosing non-DEHP bags[J]. Vox Sanguinis， 2017，112(2)：149.

[2] 林鈮，靳洪濤，王愛平. 醫療器械中增塑劑的應用和安全性研究進展[J]. 中國藥物警戒，2014，11(2)：100-103.

[3] 徐毅，薛山，賀稚非，等. 食品包裝中增塑劑DEHP毒性特點及遷移研究進展[J]. 食品工業科技，2013，34(21)：385-389.

[4] 王繼鵬，楊彥，李定龍. 水環境中DEHP污染現狀及其去除的研究進展[J]. 化工進展. 2014，2：498-504.

[5] MADKOUR N K. Beneficial role of celery oil in lowering the di(2-ethylhexyl) phthalate-induced testicular damage[J]. Toxicol Ind Health，2014，30(9)：861-872.

[6] TANG J Q，YUAN Y，WEI C X，et al. Neurobehavioral changes induced by di(2-ethylhexyl) phthalate and the protective effects of vitamin E in Kunming mice[J]. Toxicol Res，2015，4(4)：1006-1015.

[7] HAO Y，LI Q Z，ZHENG G Y. Pathology changes of kidney in mouse following DBP&DEHP exposure[M]//CHEN S，LIU Z T，ZENG Q. Advanced Materials Research.2012： 554-556，1660-1663.

[8] CHEN H，ZHANG W，RUI B B，et al. Di(2-ethylhexyl)phthalate exacerbates non-alcoholic fatty liver in rats and its potential mechanisms[J]. Environ Toxicol Pharm，2016，42：38-44.

[9] 吳微. 鄰苯二甲酸酯暴露及其對兒童生長發育影響的研究[D].武漢：華中科技大學，2015.

[10] POCAR P，FIANDANESE N，BERRINI A，et al. Maternal exposure to di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) promotes the transgenerational inheritance of adult-onset reproductive dysfunctions through the female germline in mice[J]. Toxicol Applied Pharm，2017. 322：113-121.

[11] 董瑞娜，戴紅. DEHP對雄性生殖系統毒性的研究進展[J]. 世界最新醫學信息文摘，2016，90：57-59.

[12] 章子貴，許曉路，申秀英. 不同硒水平對大鼠免疫力和血細胞的影響[J]. 微量元素與健康研究，2005，2：1-2.

[13] 唐嘯. DEHP通過氧化應激和Fasl途徑誘導GC-2spd細胞凋亡[D]. 武漢：武漢科技大學，2016.

[14] BORNEHAG C G，SUNDELL J，WESCHLER C J，et al. The association between asthma and allergic symptoms in children and phthalates in house dust：a nested case-control study[J].Environ Health Perspect，2004，112(14)：1393-1397.

[15] KOIKE E，INOUE K，YANAGISAWA R，et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate affects immune cells from atopic prone mice in vitro[J]. Toxicology，2009，259(1/2)：54.

[16] NISHIOKA J，IWAHARA C，KAWASAKI M，et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate induces production of inflammatory molecules in human macrophages[J]. Inflam Res， 2012，61(1)：69-78.

[17] 羅鵬，張愛華，吳應寬，等. 三氧化二砷對大鼠血細胞參數影響的實驗分析[J]. 貴陽醫學院學報，2009，34(4)：374-377.

[18] 王先慶. 鉛作業工人血細胞損害早期指標探討[J]. 中國社區醫師(醫學專業)，2012，14(31)：248-249.