篩選化學過敏原的直接肽反應試驗的建立

胡培麗，劉師卜，張會亮，李 　波，王鋼力*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 　100050）

大多數化學過敏原(或其代謝物)屬于親電子劑，而蛋白質側鏈氨基酸富含電子組，為親核劑，因此能與親電過敏原反應。賴氨酸和半胱氨酸是最常被利用的，其他含親核雜原子的氨基酸，如組氨酸、蛋氨酸和酪氨酸等也可與親電過敏原反應[1]。親電過敏原通過與宿主親核蛋白中的氨基酸形成非常穩定的共價鍵(抗原蛋白復合物)，從而引發皮膚過敏反應。

由于蛋白質反應是誘導皮膚過敏的一個關鍵環節，所以有假設通過這種反應來篩選化學物的致敏能力[2-5]。 Gerberick等[5-6]建立了直接肽反應試驗(the direct peptide reactivity assay，DPRA)，通過研究肽反應動力學，監測肽的損耗來評價化學物的致敏性。該方法現已經歐洲替代試驗驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)驗證，作為皮膚致敏替代試驗的推薦方法，OECD于2015年公布了DPRA試驗指南(TG 442C)[7]。目前國內一些實驗室也正在積極開展該方法研究[8-10]，不久該方法有望納入化妝品安全技術規范。本研究通過賴氨酸/半胱氨酸肽對20種不同致敏級別化學物的致敏能力進行評估，從而在本實驗室建立了該方法，同時對目前市場上化妝品中較易殘留或添加的2種風險化學物氯仿、苯進行皮膚致敏性評估。

1　材料與方法

1.1　受試物

鄰氨基苯酚、丁子香酚、反式肉桂醛、水楊酸、α-己基肉桂醛、對苯二酚、3-甲基鄰苯二酚、香葉醇、水楊酸己酯、2-巰基苯并噻唑、十二烷基硫酸鈉、異丁香酚、乙二胺與水楊酸甲酯購自Sigma公司；丙二醇、異丙醇、正己烷、氯仿與苯購自國藥集團化學試劑有限公司；2,4-二硝基氯苯購自中國醫藥總公司北京分公司。

1.2　試劑和儀器

賴氨酸肽(Ac-RFAAKAA-COOH)、半胱氨酸肽(Ac-RFAACAA-COOH)由吉爾生化(上海)有限公司合成，純度≥98%。醋酸銨、氨水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氟乙酸為分析純，購自Sigma公司。乙腈為色譜純，購自賽默飛世爾科技有限公司，高效液相色譜為Waters e2695 Alliance。

1.3　方法

1.3.1受試物與肽反應體系[5-7]受試物用乙腈配制成100 mmol/L，賴氨酸/半胱氨酸肽分別用100 mmol/L乙酸銨緩沖液(pH=10.2)/磷酸緩沖液(pH=7.5)配制成1.25 mmol/L肽儲備液。每個受試物測試3份平行樣，其中含0.5 mmol/L肽(400 μL)、5或25 mmol/L受試物(50或250 μL)及緩沖液(350 μL)。肽/受試物比例為1∶10(半胱氨酸)或1：50(賴氨酸)，1∶10比例反應樣本中需另加200 μL乙腈；同時設置空白對照(400 μL肽儲備液、350 μL緩沖液和250 μL乙腈)和共洗脫對照(賴氨酸肽：750 μL乙酸銨緩沖液和250 μL受試物；半胱氨酸肽：750 μL磷酸緩沖液、50 μL受試物和200 μL乙腈)。每個樣本管密封、混勻、室溫反應24 h，經0.22 μm微孔濾膜過濾后進行高效液相色譜檢測分析。

1.3.2標準曲線繪制[6]用25%乙腈乙酸銨/磷酸緩沖液分別配制賴氨酸/半胱氨酸肽系列標準溶液，濃度為0.015 6、0.031 3、0.062 5、0.125、0.25、0.50、1.0 mmol/L，過濾后進行高效液相色譜檢測，用系統EmpowerTM3軟件繪制標準曲線。

1.3.3檢測系統及條件[6-7]高效液相色譜檢測系統由Waters Alliance e2695和Waters 2489 紫外/可見光檢測器組成。色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18 4.6 mm×250 mm×5 μm；柱溫30 ℃；流動相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流動相B：0.085%三氟乙酸乙腈溶液；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL。梯度洗脫條件為：90%(A) 到60%(A)，25 min，流速0.8 mL/min。二極管陣列探測器掃描波長210～400 nm，色譜圖檢測波長是220 nm。

1.3.4受試物與兩種肽反應時間優化 為了解化學物與兩種肽反應動力學過程，即不同時間點肽損耗，從而確定試驗反應最佳時間，我們測定了5種不同致敏級別受試物與兩種肽分別反應5、15、30 h 時的肽損耗。

1.4　數據處理

用EmpowerTM3軟件分析反應前后的峰面積，計算肽的損耗率，≥10%則認為受試物與肽有反應[5]。損耗率=[1-(肽與受試物反應的峰面積均值/空白對照的肽峰面積均值)]×100。

1.5　預測模型[7]

若受試物與賴氨酸/半胱氨酸肽均不發生共洗脫，則用兩種肽損耗率的均值判斷，0%≤均值≤6.38%，微反應，為致敏陰性；6.38%＜均值≤22.62%、22.62%＜均值≤42.47%、42.47%＜均值≤100%，均為致敏陽性，反應級別依次為低、中、高。當受試物與賴氨酸肽發生共洗脫，則用半胱氨酸肽損耗率判斷，0%≤均值≤13.89%，微反應，為致敏陰性；13.89% ＜均值≤23.09%、 23.09%＜均 值 ≤ 98.24%、 98.24%＜均 值 ≤100%， 均為致敏陽性，反應級別依次為低、中、高。當受試物與賴氨酸/半胱氨酸肽均發生共洗脫，則該方法不適用判定受試物致敏性。

1.6　預測能力評價

根據賴氨酸/半胱氨酸肽與18種已知致敏性化學物反應損耗確定兩種肽的靈敏度、特異性、陽性預測率、陰性預測率和準確度，從而綜合評價兩種肽的預測能力。

2　結果

2.1　受試物與兩種肽反應時間的優化

5種受試物分別與賴氨酸/半胱氨酸肽反應5、15、30 h，結果表明：2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、水楊酸和鄰苯氨基苯酚均隨著時間增加肽損耗率也相應增加；反式肉桂醛與半胱氨酸肽反應肽損耗率較為穩定，而與賴氨酸肽反應隨時間增加肽損耗率遞減，但反應15～30 h時間段肽損耗率遞減緩慢，趨于穩定。鑒于Gerberick等[5-6]有關報道和OECD指南中推薦受試物與肽反應時間分別為24 h和(24±2) h，所以我們后續試驗各受試物與肽反應時間均為24～28 h。

圖1　賴氨酸肽與不同受試物反應動力學圖

2.2　20種受試物與兩種肽反應結果

圖2　半胱氨酸肽與不同受試物反應動力學圖

高效液相色譜檢測結果顯示20種受試物均未與半胱氨酸/賴氨酸肽發生共洗脫，選用兩種肽損耗率均值判斷受試物致敏性及其反應活性級別(表1)，兩種肽對受試物致敏性的預測結果見表2。

表1　20種受試物與半胱氨酸/賴氨酸肽反應活性(肽損耗率，%)

半胱氨酸肽 賴氨酸肽 半胱氨酸/賴氨酸肽靈敏度 100.00% 33.30% 100.00%特異性 100.00% 100.00% 100.00%陽性預測率 100.00% 100.00% 100.00%陰性預測率 100.00% 42.90% 100.00%準確度 100.00% 55.60% 100.00%

2.2.1半胱氨酸肽損耗率 5種強或極強致敏物肽損耗率均大于10%(4種大于99%)，4種中等致敏物肽損耗率均大于10%(3種大于67%)，3種弱致敏物肽損耗率均大于20%(21%～52%)，6種非致敏物肽損耗率均小于3%，致敏性未知的氯仿與苯均未與肽反應(肽損耗率＜2%)。預測化學物致敏性靈敏度、特異性、陽性預測率、陰性預測率和準確度均為100%。

2.2.2賴氨酸肽損耗率 5種強或極強致敏物中4種肽損耗率大于20%(24%～72%)，水楊酸己酯未與肽反應(肽損耗率小于2%)；4種中等致敏物、3種弱致敏物和6種非致敏物均未與肽反應(肽損耗率＜10%)；致敏性未知的氯仿和苯也未與肽反應(肽損耗率＜2%)。預測化學物致敏性靈敏度、特異性、陽性預測率、陰性預測率和準確度分別為33.3%、100.0%、100.0%、42.9%、55.6%。

2.2.3半胱氨酸/賴氨酸肽損耗率均值 18種已知致敏性受試物中12種肽損耗率均值大于6.38%，為致敏陽性；6種肽損耗率均值小于6.38%，為致敏陰性，與LLNA致敏分類一致。致敏性未知的氯仿和苯肽損耗率均值均小于6.38%，為致敏陰性，與我們前期研究中LLNA法評估結果一致。5種強或極強致敏物中4種為高反應活性，1種為低反應活性；4種中等致敏物中3種為中反應活性，1種為低反應活性；3種弱致敏物中2種為低反應活性，1種為中反應活性；6種非致敏物均為微反應活性；致敏性未知的氯仿與苯均為微反應活性。預測化學物致敏性靈敏度、特異性、陽性預測率、陰性預測率和準確度均為100.0%。

3　討論

目前化學物致敏性評價替代方法較多，如LLNA法[11-15]、 細胞法[16-19]、 化學法[5-6]、 計算機法[20]等，其中LLNA法較成熟，可較好地評價化學物的致敏性及其致敏強度。由于動物福利及歐盟化妝品條例要求逐步廢除動物實驗，因此發展高效、全面、安全的體外替代方法迫在眉睫。

本研究建立的化學法DPRA，簡單快捷、易操作。但該方法要求測試化學物應溶于適當的溶劑制成終濃度100 mmol/L，同時需要測試化學物與肽間確定的物質的量比值，因此不能用于測試未知組成的復雜混合物、未知或可變組成的物質、復雜的反應產物或生物材料，所以開發基于重量法的新的預測模型很有必要[7]。此外該方法不適用于測試金屬化合物，因為已知金屬化合物與蛋白質反應形成非共價鍵[7]。

DPRA方法是化學反應，不涵蓋代謝系統，對于需要酶促生物活化反應的非親電性致敏原易出現假陰性[7，21]。 Gerberick等[22-23]對該方法進行了改良，即在致敏原與賴氨酸/半胱氨酸肽酶促反應中加入辣根過氧化物酶-過氧化氫(HRP /P)，使抗原前體轉變為抗原，從而使該方法也適用于抗原前體物(屬非親電物質)的檢測。該改良法提高了檢測的靈敏度，發展前景較好。

有關研究表明該方法實驗內重現性為85%，實驗室間重現性為80%[24]。 已發表文獻[25]和 驗證結果[26]表明：與LLNA結果比較，DPRA方法鑒別致敏劑與非致敏劑的準確性為80%，靈敏度為80%，特異性為77%；而本研究中DPRA方法對18種已知致敏性化學物進行鑒別，其準確性、靈敏度、特異性均為100%；表明該方法適宜高通量對化學物致敏性進行篩選，可將該方法在國內進一步推廣應用。

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