密旋鏈霉菌Act12遺傳轉化系統的建立與優化

李曉霞 ，馬怡茗，文冰潔，舒偉學，薛泉宏，賈良輝 ，顏　華

(1.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌　712100; 2.西北農林科技大學 環境資源學院，陜西楊凌　712100)

鏈霉菌(Streptomyces)是一類高G+C 含量的革蘭氏陽性細菌，能夠產生種類繁多的次級代謝產物，如抗生素、色素、酶抑制劑、免疫調節劑等。目前所發現的12 000 余種天然抗生素中約2/3由鏈霉菌產生，其中許多已在人類醫藥(如抗腫瘤等)、農業和畜牧業中體現出重要的應用價值[1-2]。

密旋鏈霉菌(Streptomycespactum)Act12是西北農林科技大學資源環境學院薛泉宏教授從青藏高原土壤中分離到的1株鏈霉菌[3]。前期研究表明，Act12對6種土傳病原真菌木賊鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、尖孢鐮刀菌西瓜專化型、芬芳鐮刀菌、尖孢鐮刀菌棉花專化型、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型均有拮抗作用[4]；對蘋果腐爛菌、油菜菌核菌等多種植物病原菌也有很強的抑制作用，具有良好的生防應用潛質。同時，Act12對草莓[3]、甜瓜[5]、魔芋[6]等作物有良好的促生作用，并能增強魔芋的抗病能力。目前的研究主要集中在Act12的生防及促生的理化試驗方面，對其具體的分子機理研究甚少。而要研究其分子機理并進一步開發利用，首要條件則是建立合適的遺傳轉化系統。

鏈霉菌中常用的外源遺傳物質導入的方法有原生質體轉化、電轉化以及接合轉移。鏈霉菌通常有很強的限制修飾系統[6]，接合轉移由于操作相對簡便，外源基因不易受到宿主的限制性修飾[7]，較常用于鏈霉菌的遺傳轉化。大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉移的方法在1989年首次報道[8]，特別是在使用甲基化缺陷型大腸桿菌作為供體以及大量大腸桿菌鏈霉菌穿梭質粒被成功構建后[9]，該方法被進一步優化，廣泛應用于鏈霉菌的遺傳轉化操作。由于接合轉移過程中涉及多種因素，而不同的鏈霉菌種又有不同的特性，所以針對不同的鏈霉菌種，甚至鏈霉菌株，往往需要對接合轉移條件進行改進與優化，達到將外源遺傳物質高效導入的目的。近年來，仍有大量鏈霉菌通過接合轉移的方法成功構建遺傳轉化體系，如xinaomycins產生菌諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)[10]，Toyocamycin產生菌淀粉產色鏈霉菌1628(Streptomycesdiastatochromogenes1628)[11]，Streptovaricin產生菌壯觀鏈霉菌NRRL2994(StreptomycespectabilisNRRL2994)[12],以及Azalomycin F產生菌鏈霉菌211726[13]遺傳轉化系統的構建。

在對Act12進行全基因組測序的基礎上，通過生物信息學分析發現其中有大量可能的次級代謝產物基因簇，包括：PKSⅠ(Ⅰ型聚酮合酶)、PKSⅡ(Ⅱ型聚酮合酶)、NRPS(非核糖體肽)、Lassopeptide(套索肽)、Terpene(萜類)生物合成基因簇等。為了對其展開研究，進而探討其活性機理，本試驗通過對接合轉移過程涉及的多個因素進行優化，建立了Act12的高效遺傳操作系統。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1菌株與質粒試驗所用菌株：受體菌為密旋鏈霉菌Act12，供體菌為大腸桿菌S17-1，質粒克隆宿主菌為DH5a。

本研究所用質粒：pSET152為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭整合型質粒，帶有阿普霉素抗性基因[9]；pMD18-T載體帶有Amp抗性，購于TAKARA公司; pKC1139溫敏穿梭質粒，帶有Apr抗性，在大腸桿菌中39 ℃不能自主復制[9]。

1.1.2培養基和抗生素Act12的固體培養為高氏一號，液體培養為TSB[14]；接合轉移使用的培養基有：高氏一號、2CMY，改良2CMY、GSY、MS、MS(+質量分數0.1%的KNO3)以及MS(質量分數0.05% 的MgSO4)[15]；孢子預萌發培養基為2×YT[15]；接合子傳代和篩選使用的培養基分別為高氏一號和TSB[15]；發酵培養基為SPY(胰蛋白胨質量分數0.2%，酵母提取物質量分數0.4%，淀粉質量分數1%，氯化鈉質量分數0.8%，pH=7.2)；大腸桿菌培養基為LB。

抗生素使用的質量濃度為：卡那霉素(Kan) 50 mg/L, 阿普霉素(Apr) 50 mg/L ，萘啶酮酸25 mg/L，氨芐青霉素(Amp)100 mg/L。

1.2　方 法

1.2.1抗生素耐受測定選取卡那霉素、阿普霉素、紅霉素、潮霉素以及萘啶酮酸5種抗生素分別加入固體高氏一號培養基中，至質量濃度分別為0、1、2、4、6、8、10 mg/L。劃線接種Act12孢子在28 ℃培養10 d。觀察菌種生長情況。

1.2.2常用的分子生物學方法大腸桿菌轉化和質粒提取參照分子克隆指南[16]；鏈霉菌基因組DNA提取參考鏈霉菌操作手冊[15]。

1.2.3接合轉移將穿梭整合型質粒pSET152通過熱激法轉入大腸桿菌S17-1中，得到供體菌S17-1/pSET152。挑取單克隆接種于5 mL LB液體試管中(含Apr 50 mg/L、Kan 50 mg/L)，37 ℃ 過夜培養后按照體積比1∶100的比例接種于40 mL的 LB液體培養基，37 ℃、180 r/min至OD600為0.4～0.6，離心收集菌體，并用等體積的新鮮LB液體清洗菌體2次，然后將菌體懸浮于0.5 mL的LB培養基中備用。同時刮取在高氏一號培養基上生長8 d的新鮮Act12孢子，放入加有玻璃珠及10 mL無菌水的100 mL錐形瓶中，28 ℃搖床上振搖30 min破碎孢子，然后用無菌脫脂棉過濾后7 000 r/min離心10 min后倒掉上清，用0.5 mL的2×YT重懸孢子，45～55 ℃熱激10 min預萌發后，37 ℃、150 r/min萌發2～3 h。將備用的大腸桿菌和萌發好的Act12孢子按照體積比1∶1的比例混合，每150 μL涂布于接合轉移培養基上，28 ℃培養16～20 h后涂布萘啶酮酸(質量濃度25 mg/L)和阿普霉素(質量濃度1～10 mg/L), 28 ℃繼續培養3～5 d后可觀察接合子。本試驗中供體大腸桿菌數量保持108不變，受體Act12孢子量從105～108以10倍遞增。以肉眼可分辨的接合子為準，接合效率用接合子數除以孢子量表示，數據取3次試驗平均值。

1.2.4PCR驗證接合子長出的接合子在帶有抗性的高氏一號培養基上抗性交替傳代4次后接種于TSB液體培養基中培養3 d，提取基因組DNA作為PCR模版。根據pSET152質粒上帶有的Apr抗性基因設計上下游引物，以Act12基因組DNA為陰性對照模版，pSET152質粒DNA為陽性對照模版，擴增Apr抗性基因。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環；72 ℃ 7 min。

引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列如下：AMF 5′-3′ GGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC；AMR 5′-3′ ATGAGCTCAGCCAATCGACTGG[17]。

1.2.5 敲除突變株 Δspa0520的獲得與篩選通過antiSMASH網站分析Act12全基因組草圖序列，找到一個預測為Lassopeptide的基因簇，對該基因簇內的基因進行分析，推測其中的TetR家族調控基因 spa0520可能為負調控基因，嘗試用同源重組的方法將該基因阻斷使其不能表達，看能否激活這個基因簇，從而產生新的次級代謝產物。

從pET28a載體上擴增得到kanamycin抗性基因片段，連入pMD18-T載體測序正確后得到pMD18-T-Kan質粒載體。

設計上游同源片段引物：

spa0520-U-F(p1)(EcoRI) 5′-3′GGAATTCCCGGGAAGATCAACCTCGA；

spa0520-U-R(p2)(XbaI) 5′-3′ GCTCTAGAGCCGCTTACAGCGCCTTTG。

PCR擴增得到 spa0520基因上游同源片段即為U，用EcoRⅠ和XbaⅠ分別雙酶切pMD18-T-Kan質粒和PCR擴增得到的片段U，得到帶有EcoRⅠ和XbaⅠ粘性末端的線性pMD18-T-Kan和U片段，使用T4連接酶將其進行連接，得到pMD18-T-Kan-U質粒。

設計下游同源片段引物：

spa0520-D-F(p3)(PstⅠ)5′-3′ AACTGCAGGACGGGAGGGGAGCCCCTT； spa0520-D-R(p4)(HindⅢ)5′-3′ CCCAAGCTTGACACCGTCGTCGTCTGCT。

PCR擴增得到 spa0520基因下游的同源片段即為D，用PstⅠ和HindⅢ分別雙酶切pMD18-T-Kan-U質粒和PCR擴增得到的片段D，得到帶有PstⅠ和HindⅢ粘性末端的線性pMD18-T-Kan-U和D片段，使用T4連接酶連接得到pMD18-T-Kan-U-D質粒。使用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切pMD18-T-Kan-U-D和pKC1139質粒，得到線性的pKC1139和U-Kan-D片段，連接后即得用于基因敲除的質粒pKC1139-U-Kan-D，命名為pKT0520質粒。

將轉入質粒pKT0520的大腸桿菌S17-1與Act12通過大腸桿菌-鏈霉菌之間的接合轉移技術，成功地將重組質粒pKT0520轉至Act12中，獲得相關接合子，該接合子可在含有卡那霉素(質量濃度為10 mg/L)、阿普霉素(質量濃度為10 mg/L)和萘啶酮酸(質量濃度為25 mg/L)的高氏一號固體培養基上篩選獲得，培養溫度為28 ℃。刮取長勢良好的接合子孢子，利用劃線稀釋法涂布于含有卡那霉素和萘啶酮酸的高氏一號固體培養基上，置于40 ℃培養。由于pKC1139的溫敏型復制子在高于39 ℃時不能復制，迫于選擇壓力重組質粒pKT0520依靠同源臂與宿主染色體發生同源重組整合到宿主Act12染色體上(圖1)，從而獲得相關雙交換敲除突變菌株。

圖1　敲除質粒pKT0520 與Act12染色體同源區域發生雙交換的示意圖Fig.1　Schematic diagram of gene replacement between plasmid pKT0520 and chromosomes of Act12

將溫敏篩選獲得的單克隆敲除子傳代至含有卡那霉素的高氏一號固體培養基上進行擴大培養，隨后將長勢良好的敲除子印記到安普霉素抗性平板上，篩選獲得安普霉素敏感的雙交換突變株 Δspa0520，最后用相關引物進行PCR擴增驗證。

1.2.6菌株發酵與代謝產物分析收集Act12及突變株 Δspa0520的新鮮孢子接種于100 mL的TSB種子培養基，28 ℃振蕩培養48 h；按體積比1∶10的比例轉種于200 mL的SPY發酵培養基，28 ℃振蕩培養7 d后。將發酵物按體積比1∶1的比例用乙酸乙酯萃取3次，收集上層有機相并將上層有機相利用旋轉蒸發儀蒸發濃縮至干，濃縮獲得的萃取物溶于1 mL甲醇，并用0.22 μm的有機濾膜過濾除菌，用于后續的HPLC檢測。HPLC條件：C18反向柱； 流動相A為水，B為甲醇，梯度洗脫(0～5 min，10% B；5～35 min，10%～100% B；35～45 min，B；45～50 min，100%～10% B)(體積比)；流速1 mL/min；進樣量25 μL；檢測波長210 nm。

2　結果與分析

2.1　密旋鏈霉菌Act12對抗生素的敏感性測試

為了確定可用于密旋鏈霉菌Act12遺傳轉化操作的抗性選擇標記，分別檢測Act12對卡那霉素、阿普霉素、紅霉素、潮霉素的耐受度。另外，為保證萘啶酮酸在抑制大腸桿菌時不會對Act12的生長有影響，同時測定Act12對萘啶酮酸的耐受度。結果如表1所示，Act12對阿普霉素和卡那霉素非常敏感，在質量濃度為1.0 mg/L的阿普霉素和卡那霉素平板上不能生長；對潮霉素比較敏感，在質量濃度為4.0 mg/L的潮霉素平板上不能生長；對紅霉素和萘啶酮酸不敏感，在質量濃度為25.0 mg/L的紅霉素和萘啶酮酸平板上可以生長。表明阿普霉素和卡那霉素抗性基因可以用來作為Act12遺傳操作的抗生素選擇標記。

2.2　接合轉移培養基的選擇

試驗選擇7種不同的接合轉移培養基，分別是高氏一號、2CMY，改良2CMY(+質量分數0.1% KNO3)、GSY、MS、MS(+質量分數0.1%KNO3)以及MS(質量分數0.05%MgSO4)。其中高氏一號是Act12生長的最適培養基，而2CMY、GSY和MS是3種比較經典的接合轉移培養基，其余幾種培養基則是根據文獻報道對其進行了適當改良。

結果(表2)表明，無論是原始的MS培養基，還是2種改良后的MS培養基，均沒有接合子長出。在改良2CMY、GSY、高氏一號培養基上可以長出接合子，其中改良2CMY的接合子數量最多；GSY接合子生長旺盛與大腸桿菌混在一起，難以挑取單菌落；高氏一號上面接合子數量較少。因此，選擇改良2CMY培養基作為接合轉移培養基。

表1　密旋鏈霉菌Act12對不同抗生素的敏感性Table 1　Sensitivity of Streptomyces pactum Act12 to antibiotics

注：“-” Act12不生長；“+”Act12生長微弱；“++”Act12生長良好。

Note:“-” Act12 don’t grow；“+”Act12 growth is weak；“++”Act12 grows well.

2.3　熱激溫度及時間對接合轉移效率的影響

熱激處理的目的是為了促進孢子預萌發，孢子預萌發是影響接合效率的一個重要因素。試驗中選取45 ℃、50 ℃、55 ℃，每個溫度分別熱激處理5 min、10 min、15 min，然后在37 ℃搖床上萌發2.5 h。結果見表3～4：在50 ℃ 熱激10 min的預萌發條件下接合效率最高為2.079×10-5。當溫度在55 ℃時并沒有接合轉化子出現。因此，確定孢子最佳預萌發條件為50 ℃熱激10 min。

表2　密旋鏈霉菌Act12在不同培養基上的接合轉移效率Table 2　Conjugation transfer efficiency of Streptomyces pactum Act12 on different media

2.4　接合轉移時間和抗生素濃度對接合轉移效率的影響

接合轉移時間選擇3個時間段(表5)，分別為16 h、18 h和20 h。將供體大腸桿菌和受體孢子等體積混合涂布在接合轉移培養基之后，在28 ℃培養箱中分別培養16 h、18 h和20 h，然后涂布萘啶酮酸(質量濃度25 mg/L)和適量的阿普霉素。阿普霉素質量濃度選擇4個梯度，分別為0、3 mg/L、6 mg/L、10 mg/L。涂布抗生素后繼續在28 ℃培養箱中培養3～5 d。不同接合轉移時間和抗生素濃度下的接合轉移結果分別見表5和表6。

由結果可知，Act12的接合轉移最適時間是18 h。最適Apr抗生素質量濃度是10 mg/L。

表3　熱激溫度對接合轉移效率的影響Table 3　Influence of heat temperature on conjugation frequency

表4　熱激時間對接合轉移效率的影響Table 4　 Influence of heat time on conjugation frequency

表5　接合轉移時間對接合轉移效率的影響Table 5　Influence of conjugate transfer time on conjugation frequency

表6　抗生素質量濃度對接合轉移效率的影響Table 6　Influence of antibiotics mass concentration on conjugation frequency

2.5　接合子的驗證

通過優化后的方法，質粒pSET152能以較高的效率轉入Act12中。由于pSET152是整合型質粒，需要整合到Act12的基因組上才能獲得穩定的接合子。隨機挑選接合子，在TSB液體培養基中培養3 d后收集菌絲體，提取基因組DNA，用阿普抗性基因的引物進行PCR擴增。以野生型Act12基因組DNA為陰性對照模版，pSET152質粒DNA為陽性對照模版。PCR結果如圖2所示。

由圖2可以看出，質粒pSET152和接合子DNA均擴增出Apr抗性基因的條帶，而野生型Act12基因組DNA未擴增出條帶,由此可以證明pSET152已成功轉入Act12中。

P.質粒pSET152的PCR驗證產物PCR-amplified bands of plasmid pSET152；Wt.野生型Act12基因組DNA的PCR驗證產物PCR-amplified bands of wild-type Act12 genetic DNA；M.DL2000 maker；1～3.接合子的PCR驗證產物PCR-amplified bands of exconjugants

圖2接合子的PCR驗證
Fig.2PCRidentificationofexconjugants

為了驗證接合子的遺傳穩定性，隨機挑選100個接合子在只加入萘啶酮酸和加入萘啶酮酸以及阿普霉素的高氏一號培養基上進行抗性交替傳代，傳代4次后接合子仍生長良好，沒有出現抗性消失的菌落。再挑取10個接合子接入加有萘啶酮酸和阿普霉素的TSB液體培養基中培養，均可以生長，提取總DNA，經PCR驗證后與之前的接合子驗證結果一致。表明pSET152質粒可以在Act12中穩定遺傳。

2.6　 spa0520基因的敲除與驗證

通過溫敏篩選得到雙交換的 spa0520基因缺失突變株 Δspa0520。提取相關基因組DNA，使用引物 spa0520-U-F(p1)和 spa0520-D-R(p4)進行PCR驗證。PCR相關驗證表明 spa0520基因的雙交換缺失突變株構建成功。

圖3中，Act12對應的PCR擴增條帶大約為1.8 kb，而 spa0520基因缺失突變株 Δspa0520對應的PCR擴增條帶大約為2.2 kb，PCR試驗結果與預期相符(圖1)，證實 spa0520基因缺失突變株 Δspa0520構建成功。

圖3　PCR擴增驗證 spa0520基因缺失突變株Fig.3　PCR amplification of spa0520 deleted mutant

2.7　突變株次級代謝產物變化分析

野生型Act12和突變株 Δspa0520的發酵液HPLC分析結果見圖4。HPLC檢測結果表明：在出峰時間30 min的位置，突變株 Δspa0520對應的吸收峰顯著增強，對應的化合物命名為X；通過積分面積求得X的產量較之于野生型Act12的產量提高了6倍。基因敲除試驗結果表明，在Act12中 spa0520基因對化合物X的生物合成起負調控作用。

此外，利用濾紙片法對Act12和 Δspa0520的發酵萃取液的抑菌活性進行相應檢測。試驗結果表明，突變株 Δspa0520較之于野生型Act12對蘋果腐爛病菌、核桃潰瘍病菌、油菜菌核病菌和小麥根腐病菌的拮抗活性明顯增強，本試驗結果預示著化合物X可能具有抗真菌活性；為此筆者將化合物X進行分離純化，最后鑒定化合物X為寡霉素D。已有研究表明寡霉素D具有良好的抗真菌活性，這與本試驗所涉及的有關發酵產物抑菌活性檢測的試驗結果相吻合(該部分試驗結果另文發表)。

圖4　Act12和 Δspa0520發酵產物的HPLC檢測結果Fig.4　HPLC chromatograms of fermentation broth from Act12 and Δspa0520

3　討 論

本試驗以密旋鏈霉菌Act12為出發菌株，建立其遺傳轉化系統并進行了優化，為后期研究其機理并進一步開發其應用價值奠定了基礎。鑒于接合轉移具有操作相對簡便等優點，本試驗優先利用接合轉移法建立其遺傳轉化系統。

Act12遺傳轉化系統的建立，促使對其進行遺傳操作成為可能，這為后續對Act12進行機理研究以及進一步開發利用奠定了堅實的基礎。

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