二乙酰二去水衛矛醇對肺癌細胞NCI?H460增殖及凋亡的影響

吳余燕　徐佳佳　鄧超澄　劉華鋼　湯婷婷

1廣西中醫藥大學藥學院（南寧 530001）；2廣西醫科大學藥學院（南寧 530021）

肺癌是目前世界各國最常見的惡性腫瘤之一，也是男性病死率最高的惡性腫瘤，治療效果差，術后易復發［1-2］。因此，研究更多高效低毒的藥物用于治療或輔助治療肺癌是許多學者的研究方向。二乙酰二去水衛矛醇（DADAG）是將去水衛矛醇（DAG）結構的3，4位羥基酯化得到［3］。本課題組前期研究［4-7］證實DAG對肺癌、腦腫瘤、卵巢癌等腫瘤細胞有明顯的抑制作用。其他學者［8-11］發現DADAG對肝癌細胞HLE、BEL?7404、SMMC?7721、白血病L1210細胞的生長有明顯的抑制作用。本研究通過探討DADAG對肺癌細胞株NCI?H460增殖和凋亡的影響，從而為尋找出更多治療肺癌的化療藥物提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1試劑與藥物RPMI1640培養基（賽默飛世爾儀器有限公司）；胎牛血清（維森特生物技術有限公司）；PBS（0.01 mol/L）、青鏈霉素混合液（100 U/mL）、MTT、Giemsa染色液（北京索萊寶科技有限公司）；AO/EB染色液、細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；RNAiso Plus試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、PrimeScriptTMRTreagent Kit（日本TaKara公司）；DADAG由廣西醫科大學有機與藥物化學教研室提供，用RPMI1640培養基溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾后-20℃保存，臨用前用培養基稀釋到所需濃度。

1.2細胞肺癌細胞株NCI?H460購買于中國科學院細胞庫。

1.3儀器311型CO2培養箱（Thermo Fisher scien?tific，USA）；SpectraMaxPlus384型酶標儀（Tecan Austria GmbH）；CFM?500E型倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠出品）；FacsCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickson公司）；7300型Real?time PCR System（美國ABI公司）。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養細胞于25 cm2培養瓶中以配好的完全培養基（含10%的胎牛血清和青鏈霉素混合液）培養于37℃、5%CO2培養箱中，實驗均采用對數期增殖細胞。

1.4.2細胞增殖抑制率的測定（MTT法）取NCI?H460細胞調整密度為5 000/孔接種于96孔板中，細胞貼壁24 h后，加入含不同濃度DADAG的完全培養液100 μL，同時設置不含藥的空白對照組，設置4個復孔。放置37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，培養箱中繼續培養4 h，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解，于490 nm波長酶標儀測定吸光度值（OD）。實驗重復3次。抑制率=（1?實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4.3集落形成實驗檢測細胞集落形成能力接種細胞500/孔于6孔板中，每孔1 mL。37℃，5%CO2培養箱中培養144 h，倒置顯微鏡下觀察細胞增殖情況。待單個細胞分裂至30～50個細胞后，算一個集落的形成。棄去孔內培養基，分別加含DADAG 11.50、23.00、46.00、69.00 μg/mL的完全培養基，1.5 mL，設置1個空白對照孔，培養箱中培養48 h后終止培養，棄去孔內液體，PBS清洗2遍，每孔加入1 mL甲醇固定10 min，棄去甲醇空氣中干燥。用Giemsa染色液染色10 min，PBS清洗2遍，干燥，拍照觀察。

1.4.4AO/EB染色接種細胞45×104/孔于6孔板中，每孔1 mL，設置空白對照孔。于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h，給藥組分別加入含DADAG 11.50、23.00、46.00、69.00 μg/mL 的完全培養基1.5 mL，空白組加入等量的培養基。在37℃，5%CO2培養箱中培養48 h后終止培養。小心棄去孔內液體，PBS沖洗2遍，每孔加入1 mL的PBS后，再加入20 μL的AO/EB混合液，染色2～3 min。倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.5細胞凋亡狀況的檢測按照“1.4.4”方法處理細胞，DADAG作用48 h后，按照細胞凋亡試劑盒說明步驟處理細胞，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4.6RT?PCR檢測凋亡相關基因的表達按照“1.4.4”方法處理細胞，DADAG作用48 h后，提取RNA，并進行RNA的定量以及純度分析，經反轉錄后的cDNA進行RT?PCR反應。基因序列來源于Gene Bank，委托TaKara公司合成，Bax F：5′?GAC?GAACTGGACAGTAACATGGA?3′，R：5′?GCAAAG?TAGAAAAGGGCGACA?3′；Bcl?2 F：5′?GTTCGGT?GGGTCATGTGT?3′，R：5′?ATCCCAGCCTCCGTTA?TCCT?3′。

1.5統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據用表示，實驗組與空白對照組之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1DADAG對NCI?H460細胞株增殖的影響DADAG（2.88、5.75、11.50、23.00、46.00 μg/mL）對H460細胞作用48 h的OD值均較空白組低，差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著給藥劑量的增大，給藥組OD值逐漸減小，說明藥物對細胞的增殖抑制作用逐漸增強。DADAG作用于H460細胞48 h的OD值及抑制率見表1。利用SPSS 17.0軟件概率單位法計算出DADAG對H460細胞的IC50值為24.79 μg/mL。根據計算出的IC50以及預實驗結果，初步確定以11.50、23.0、46.00、69.00 μg/mL進行后續實驗。

2.2DADAG作用后對H460細胞體外克隆形成能力的影響腫瘤細胞具有形成集落的能力，集落抑制實驗常用于抗癌藥物對腫瘤細胞增殖影響的觀察。不同濃度的DADAG作用于H460細胞后，與空白組比較，給藥組的集落形成明顯受到抑制，隨著給藥濃度的增大，抑制越來越強，見圖1。

表1　不同濃度DADAG對H460細胞的OD值以及抑制率Tab.1　The inhibitory rate and OD value of different concentration of DADAG on H460 cells　±s

表1　不同濃度DADAG對H460細胞的OD值以及抑制率Tab.1　The inhibitory rate and OD value of different concentration of DADAG on H460 cells　±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01

DADAG（μg/mL）0.00 2.88 5.75 11.50 23.00 46.00 OD 1.39±0.13 1.17±0.12*1.03±0.10*0.86±0.19**0.71±0.10**0.56±0.17**抑制率（%）0.00 15.68 25.82 38.17 49.30 59.61 48 h?IC50（μg/mL）24.79

2.3AO/EB染色觀察細胞形態變化經方法1.4.4染色處理的各組細胞，在熒光顯微鏡下觀察到的細胞形態如下：（1）空白組：細胞在熒光顯微鏡下核染色質呈綠色，且形態正常，細胞質透亮；（2）給藥組：細胞在熒光顯微鏡下可觀察到核染色質被呈橘紅色，且隨著給藥劑量的增加，被染成橘紅色的細胞數增多，細胞形態與空白組比較發生一定的變化，表現為細胞圓縮，不規則，見圖2。

圖1　不同濃度DADAG對H460細胞集落的影響Fig.1　Effects of different concertrations of DADAG on H460 cell colony

圖2　AO/EB熒光染色法觀察DADAG誘導H460細胞凋亡情況（200×）Fig.2　Effects of DADAG on apoptosis of H460 by AO/EB staining（200 ×）

2.4DADAG對H460細胞凋亡的影響流式細胞術檢測結果見圖3，在流式雙變量散點圖中左下象限表示活細胞，染色結果為Annexin V-PI-；左上象限表示壞死的細胞，染色結果為Annexin V-PI+；右下象限表示早期凋亡的細胞，染色結果為Annexin V+PI-；右上象限表示中晚期凋亡的細胞，染色結果為Annexin V+PI+。經DADAG處理過的細胞總凋亡率明顯高于空白組，且隨著DADAG給藥量的增加，發生凋亡的細胞數越來越多，各組總凋亡率分別為：（5.71±0.88）%，（13.10±0.87）%，（28.94±0.44）%，（40.06±0.91）%，見圖4。

2.5DADAG對H460細胞內凋亡相關基因的影響隨著DADAG給藥濃度的增加（23.00、46.00、69.00 μg/mL）NCI?H460細胞內Bcl?2的相對表達量減少，Bax的相對表達量增加，見圖5。

圖3　H460經DADAG作用48 h后的細胞總凋亡分布圖Fig.3　The distrbution of cell apopotosis of H460 cell after treated with DADAG for 48 h

圖4　H460經DADAG作用48 h后的細胞總凋亡率柱形圖（n=3，±s）Fig.4　The histogram of total cell apopotosis of H460 cell after treated with DADAG for 48 h

圖5　DADAG對NCI?H460細胞內Bcl?2、Bax mRNA表達的影響（n=3，±s）Fig.5　Effect of DADAG on Bcl?2、Bax mRNA express of H460 Cell

3　討論

目前，關于DADAG的抗癌作用已有一些報道，但其抗癌機制還未見闡明［12］。本研究發現，DADAG能夠顯著地抑制肺癌NCI?H460細胞增殖，與空白組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。DADAG能夠抑制H460細胞集落的形成，從染色結果可以看出，當DADAG濃度達到69.00 μg/mL時與空白組比較，集落數明顯減少。MTT和集落實驗提示，DADAG對NCI?H460細胞的增殖有抑制作用。細胞增殖是生命的基本特征之一，是個體發育和生命延續的基本保證，其實質是DNA的復制［13］。

細胞發生凋亡的過程中，細胞的形態會發生顯著變化，因此從細胞形態的變化分析細胞凋亡是最基本的方法。本研究根據48 h?IC50值選取了11.50、23.00、46.00、69.00 μg/mL 藥物濃度，采用AO/EB染色法進行細胞凋亡形態學的觀察。進一步用流式細胞儀定量檢測，給藥組中細胞的凋亡率隨著給藥量增加而增大。DADAG 46 μg/mL組的細胞增殖抑制率和凋亡率分別為59.61%和28.94%。該結果提示DADAG能夠引起肺癌NCI?H460細胞凋亡，但抑制NCI?H460細胞增殖作用并不完全源于其誘導凋亡的作用，DADAG也有可能調控NCI?H460細胞的細胞周期，使細胞周期發生阻滯產生一定的抑制細胞增殖作用。這一假設還需后續實驗進一步驗證。

研究［14-15］表明DADAG對肝癌細胞HLE、白血病HL?60細胞產生凋亡使細胞死亡。已發現的參與細胞凋亡的基因主要有 Bcl?2、Caspase、Bax、p53、Fas、FasL等，研究較多的一類基因是Bcl?2基因家族，Bax也屬于Bcl?2基因家族，Bax與Bcl?2分別是細胞內重要的凋亡促進蛋白和凋亡抑制蛋白［16-18］。本研究應用RT?PCR法檢測H460細胞凋亡結果提示DADAG能夠誘導肺癌細胞H460產生凋亡，其凋亡的機制可能與促凋亡基因Bax表達量上調，抗凋亡基因Bcl?2基因的表達量下調有關。

綜上所述，DADAG能夠抑制肺癌細胞NCI?H460的增殖，并誘導其產生凋亡，作用機制可能與Bax表達量上調，Bcl?2的表達量下調有關。本研究為DADAG對肺癌細胞NCI?H460體外作用機制提供了重要的理論依據，但也存在一定的局限性，本研究目前只探討了DADAG對NCI?H460的體外作用，體內作用還在摸索中；考察的基因表達譜較窄，外源性死亡受體途徑相關基因及蛋白表達譜的變化有待進一步研究。

［1］常詠梅，顏文森，江小運，等.miR?3p靶向AEG?1抑非小細胞肺癌細胞增殖［J］.實用醫學雜志，2017，14（33）：2267?2271.

［2］SIEGEL R，MA J，ZOU Z H，et al.Cancer statistics［J］.CA：Cancer J Clin，2014，64（1）：9?29.

［3］ERDEYI T V，KERPE F S，KAN Y B，et al.Pharmacokinetic study in a phase I trial with an alkylating agent，diacetyidianhy?drogalactitol（DADAG）［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1986，16（3）：257?263.

［4］梁喬芳，劉華鋼，譚強，等.二去水衛矛醇對人腦腫瘤細胞體外抑制作用［J］.廣西科學，2015，22（4）：454?456.

［5］張慧玲，王稼農，梁霜，等.二去水衛矛醇對四種腫瘤細胞的體外抑制作用［J］.廣西科學，2013，20（1）：82?84.

［6］周瑩，劉華鋼，蘇桂玉，等.二去水衛矛醇對人卵巢癌細胞的體外抑制作用［J］.廣西中醫藥大學學報，2015，18（4）：66?67.

［7］蘇桂玉，劉華鋼，黃慧學，等.二去水衛矛醇對人肺癌細胞株體外抗癌活性及機制探討［J］.中國實驗方劑學雜志，2016，22（10）：122?127.

［8］楊錦南，杜寶順，詹合琴，等.二乙酞二脫水衛矛醇對白血病L1210細胞生長的抑制作用［J］.新鄉醫學院學報，2006，23（2）：145?146.

［9］曹林枝，滕少康，廖志紅，等.雙脫水二乙酰衛矛醇對3種肝癌細胞生長的影響［J］.廣西醫科大學學報，2007，24（4）：572?574.

［10］許建功，何瑞芳，趙營，等.二乙酰二脫水衛矛醇對白血病L1210細胞增殖的抑制作用［J］.華西藥學雜志，2006，23（2）：147?148.

［11］韋怡怡，賴國麗，鄧振德，等.雙脫水二乙酰衛矛醇對人肝癌細胞生長影響的研究［J］.廣西醫科大學學報，2005，27（2）：174?176

［12］ZHANG X Y，LIAN Y X，GUO W，et al.Anticancer activity and mechanisms of diacetyldianhydrogalactitol on hepatoma QGY?7703 cells［J］.Anticancer Drugs，2009，20（10）：926?931.

［13］陳建平，張春江，趙丹，等.1，25?二羥維生素D3對人系膜細胞增殖與凋亡的影響［J］.實用醫學雜志，2014，30（3）：342?345.

［14］LAI X J，CAO L Z，ZHOU Y，et al.Apoptosis of hepatocarci?noma cell line HLE induced by the combination of wild type P53 gene and 1，2：5，6?dianhydro?3，4?diacetylgalactitol［J］.Ai Zheng，2004，23（10）：1139?1143.

［15］YANG J N，LIU J Y，XU H，et al.Apoptosis induced by di?acetyldianhydrogalactitol and its mechanism in HL?60 leukemia cells［J］.Yao Xue Xue Bao，2002，37（9）：691?695.

［16］李奎，劉英，康相濤.主要凋亡基因對細胞凋亡的調控［J］.解剖科學進展，2007，13（1）：62?65，70.

［17］ISHII H H，GOBE G C，YONEYAMA J，et al.Role of p53，apoptosis，and cell proliferation in early stage Epste?Barr virus positive and negative gastric carcinomas.［J］.J Clin Pathol，2004，57（12）：1306?1311.

［18］楊貞，郭新宇，李海霞，等.益氣法對超排卵小鼠卵巢顆粒細胞 Bcl?2、Bax、Caspase3 表達的影響［J］.實用醫學雜志，2017，13（33）：2105?2108.