喉鱗狀細(xì)胞癌組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化及臨床意義研究

曹炳　沈志森　林樂(lè)希　郝文娟　周重昌

喉癌是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌[1]；國(guó)人發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化，尤其在北方地區(qū)[2]。喉鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）是喉癌最常見(jiàn)的病理類型。喉癌的發(fā)生包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩大機(jī)制，以及吸煙、飲酒過(guò)度、病毒感染等因素的參與[3]。目前認(rèn)為，以抑癌基因啟動(dòng)子異常甲基化（會(huì)導(dǎo)致基因沉默或失活）為代表的表觀遺傳學(xué)改變是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子異常甲基化已逐步成為早期篩查腫瘤的常用方法[4-5]。人類CLDN11基因定位于3q26.2，其編碼的Claudin-11蛋白是完整的膜蛋白，為組成細(xì)胞緊密連接的主要成分，而緊密連接蛋白的異常表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的重要一步[6]。CLDN11基因表達(dá)下調(diào)會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[7]，如腦膜瘤[8]、胃癌[7]、惡性黑色素瘤[9]、口腔癌[10]、皮膚黑色素瘤[9]等。然而，CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化與喉癌的關(guān)系報(bào)道少見(jiàn)。基于此，本研究探討CLDN11基因啟動(dòng)子在LSCC組織中的甲基化水平，分析其與LSCC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并評(píng)估其對(duì)LSCC的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2011年1月至2016年1月在寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院治療的LSCC患者91例，其中男87例，女4例；年齡40～86歲，中位年齡60歲；吸煙者73例。患者術(shù)前均未接受放化療，既往無(wú)癌癥史。臨床分期采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2002），并由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行組織學(xué)確認(rèn)，其中Ⅰ、Ⅱ期44例，Ⅲ、Ⅳ期47例；高中分化鱗癌78例，低分化鱗癌13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例。手術(shù)切取LSCC組織及距癌組織邊緣0.5cm以上的癌旁正常組織立即放入液氮中，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷凍保存。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2DNA提取和亞硫酸氫鹽修飾根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen,Hilden,Germany）從LSCC組織及癌旁正常組織標(biāo)本中提取基因組DNA。使用NanoDrop 1000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Co.Ltd.,Wilmington，USA）評(píng)估DNA質(zhì)量和數(shù)量，樣品在260/280nm吸光度比值為1.8～2.0，則認(rèn)為提取的DNA純度較滿意。根據(jù)制造商的說(shuō)明書（Zymo Research,Orange,CA,USA），使用具有ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit的Methylamp DNA修飾試劑盒將洗脫的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。

1.3CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（qMSP）法。根據(jù)儀器指南，使用LightCycler 480（Roche Diagnostics,Mannheim,Germany）擴(kuò)增亞硫酸氫鹽修飾的DNA。qMSP所需引物：CLDN11-正義5′-ATAAGTTGATAGGAGAATCGAATCG-3′，CLDN11-反義5′-AACGAAAATAACCCTAAACACGTA-3′。內(nèi)參為β-actin基因（ACTB），ACTB-正義5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′，ACTB-反義5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′。PCR反應(yīng)體系為20μl，包括雙蒸水（ddH2O）6μl，模板DNA 2μl，PCR Buffer 10μl，上下游引物各1μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃20s，60℃30s，72℃30s，共50個(gè)循環(huán)。采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化通用甲基化人類DNA標(biāo)準(zhǔn)（ZYMO研究公司）作為陽(yáng)性對(duì)照。為了糾正樣品質(zhì)量和數(shù)量之間的差異，ACTB被用作內(nèi)部控制。qMSP通過(guò)甲基化指數(shù)（PMR）進(jìn)行指標(biāo)量化。PMR代表基因甲基化陽(yáng)性的模板DNA在其中所占的比例，實(shí)驗(yàn)中分別將每個(gè)樣本的甲基化Ct值，陽(yáng)參和內(nèi)參的Ct值代入以下公式計(jì)算得出：PMR=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct樣本-Ct內(nèi)參）-（Ct陽(yáng)參-Ct內(nèi)參）。

1.4觀察指標(biāo)（1）比較LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平。（2）分析LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系[11]，包括性別、年齡、有無(wú)吸煙、癌組織學(xué)類型、臨床分期、T分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。（3）評(píng)估CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平對(duì)LSCC的診斷價(jià)值。（4）以甲基化水平0.571為臨界值，將患者分為高甲基化組（30例）和低甲基化組（61例）[12]。隨訪至2017年8月，分析LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同臨床病理特征的LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；繪制ROC曲線評(píng)估CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平對(duì)LSCC的診斷價(jià)值，得出AUC、靈敏度、特異度；采用Kaplan-Meier法估計(jì)高甲基化組與低甲基化組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因甲基化水平比較見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，LSCC組織CLDN11基因甲基化水平明顯高于癌旁正常組織[（0.256±0.219）vs（0.060±0.090）,P＜0.01]。

2.2LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平與患者性別、年齡、有無(wú)吸煙、癌組織學(xué)類型均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），Ⅲ、Ⅳ期、T3～4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平分別高于Ⅰ、Ⅱ期、T1～2期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LSCC組織（均P＜0.01）。

2.3CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平對(duì)LSCC的診斷價(jià)值見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，AUC為0.884（95%CI：0.835～0.932,P＜0.01），甲基化水平為0.571時(shí)，診斷LSCC的靈敏度、特異度分別為0.923、0.736。

圖1　LSCC組織與癌旁正常組織CLDN11基因甲基化水平比較

表1　LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖2　CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平診斷LSCC的ROC曲線（箭頭示PMR最佳截?cái)帱c(diǎn)）

2.4LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平與患者預(yù)后的關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3　LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子高甲基化組與低甲基化組患者生存曲線比較

由圖3可見(jiàn)，與低甲基化組患者相比，高甲基化組患者總生存率較低（P＜0.01）。

3　討論

CLDN11基因編碼的Claudin-11蛋白屬于Claudins家族成員之一，Claudins蛋白的表達(dá)下降可能會(huì)降低細(xì)胞黏附，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[13]，已在小鼠皮膚腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中得到證實(shí)[14]。本研究分析CLDN11基因與LSCC的關(guān)系。LSCC患者早期往往無(wú)特異性臨床癥狀，特別是聲門上癌。LSCC患者常通過(guò)CT、MRI和內(nèi)鏡病理組織活檢來(lái)進(jìn)行診斷。然而，CT和MRI對(duì)LSCC診斷的靈敏度和特異度不是很理想，很少有LSCC患者通過(guò)CT或MRI可明確診斷。內(nèi)鏡病理組織活檢仍然是診斷LSCC的金標(biāo)準(zhǔn)，然而這種方法由于其侵入性而受到限制，并且不適用于大規(guī)模篩查。因此，迫切需要進(jìn)一步研究LSCC的發(fā)生機(jī)制，并尋找潛在的LSCC生物標(biāo)志物來(lái)提高早期診斷率。

抑癌基因啟動(dòng)子異常甲基化可能是腫瘤發(fā)生的早期事件。近年來(lái)，大量研究表明CLDN11基因啟動(dòng)子異常甲基化在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。Agarwal等[7]發(fā)現(xiàn)與其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織相比，胃癌組織中CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯升高，而CLDN11基因表達(dá)明顯下調(diào)，從而通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲性促進(jìn)胃癌的形成。Walesch等[9]報(bào)道與皮膚正常上皮和發(fā)育異常痣相比，惡性黑色素瘤的CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著升高。此外，Abe等[10]認(rèn)為CLDN11基因啟動(dòng)子異常甲基化與高危口腔白斑有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，LSCC組織CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯增高。這提示CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化是LSCC常見(jiàn)的特異性事件，并且有可能作為L(zhǎng)SCC早期診斷的生物標(biāo)志物。

腫瘤的臨床分期與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌重要的預(yù)后指標(biāo)，極大地影響患者的生存率及治療方案的選擇[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床Ⅲ、Ⅳ期和T3～4分期患者中明顯升高，表明CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化可能在疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

對(duì)于頭頸部腫瘤，目前已經(jīng)評(píng)估了幾種生物標(biāo)志物，以改善診斷和隨訪，包括癌胚抗原（CEA）、組織多肽抗原（TPA-M）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）和細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）。Eleftheriadou等[16]報(bào)道，CEA、TPA-M、SCCA和CYFRA 21-1在LSCC診斷中的靈敏度為0.165～0.468。本研究結(jié)果顯示，CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化水平為0.571時(shí)，診斷LSCC的靈敏度、特異度分別為0.923、0.736。這表明CLDN11基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)LSCC有較高的診斷價(jià)值。

抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化與腫瘤的的低生存率有關(guān)[17]，Meng等[18]發(fā)現(xiàn)CLDN11基因的表達(dá)水平與乳腺癌患者的生存率密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與CLDN11基因啟動(dòng)子低甲基化組患者相比，高甲基化組患者總生存率較低。這表明異常甲基化的CLDN11基因可能是預(yù)測(cè)LSCC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

不可否認(rèn)，本研究尚有不足之處。首先，本研究只包含91例樣本，需要更大樣本、多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果；其次，本研究未檢測(cè)CLDN11基因的蛋白表達(dá)水平，今后的研究可考慮。

綜上所述，LSCC組織中CLDN11基因啟動(dòng)子呈高甲基化水平，且在Ⅲ、Ⅳ期、T3～4期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中明顯增高。此外，CLDN11基因啟動(dòng)子高甲基化LSCC患者的總生存率低。CLDN11基因啟動(dòng)子高甲基化或可作為L(zhǎng)SCC診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物。

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