hsa_circ_RNA0023397和mi 106b在活動性克羅恩病腸黏膜組織中的表達(dá)及意義

沈朵，陳洪，李紅霞，徐孝新，尹瑩

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京　210009; 2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 消化科，江蘇 南京　210009)

1　材料與方法

1.1　材料

1.2　腸黏膜組織來源

腸道黏膜組織活檢標(biāo)本收集自2014年9月至2017年3月在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院患者，通過結(jié)腸鏡及病理學(xué)檢查確診為活動期CD的患者40例，其中男性25例，女性15例；最大年齡為60歲，最小年齡為19歲，平均年齡為32.3歲。對照病例選取就診于我院接受腸鏡檢查并行腸道黏膜組織活檢的健康體檢者，經(jīng)過病理學(xué)檢查提示為正常組織，總共有40例，其中男性26例，女性14例；最大年齡為55歲，最小年齡為25歲，平均年齡為34.9歲。兩組在性別構(gòu)成比、年齡等一般情況上無顯著差別，本研究對象術(shù)前均簽署知情同意書。

1.3　circRNAs組織芯片檢測

1.4　腸黏膜組織中mi 106b的表達(dá)情況檢測

用TRIzol提取腸黏膜組織總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min；用實(shí)時定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，PCR反應(yīng)后，Ct值通過設(shè)置固定閾值確定，取3次PCR的結(jié)果求平均Ct值。miRNA相對水平通過U6校正。

1.5　腸黏膜組織中ha circ_0023397的表達(dá)情況檢測

1.6　腸黏膜組織中自噬情況檢測

1.7　腸黏膜組織中ATG16L1蛋白表達(dá)檢測

1.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　　果

2.1　活動期CD腸黏膜組織中mi 106b的表達(dá)情況

2.2　circRNA組織芯片結(jié)果及活動期CD患者病變腸道黏膜組織中hsa_circ_0023397的表達(dá)情況

本課題組利用環(huán)狀RNA芯片(Arraystar公司)，對活動期CD病變腸道黏膜的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了篩查(圖2)。采用實(shí)時定量PCR方法檢測40例活動期CD患者病變腸道黏膜組織標(biāo)本及40例正常對照標(biāo)本中hsa_circ_0023397的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)活動期CD組織中hsa_circ_0023397表達(dá)低于健康對照組(P<0.01)(圖3A)。此外，統(tǒng)計(jì)分析提示，hsa_circ_0023397診斷活動性CD的ROC曲線下的面積為0.844(P<0.01)(圖3B)，靈敏度和特異度分別為0.80和0.85。

A.差異表達(dá)circRNA的火山圖，紅點(diǎn)代表差異表達(dá)的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA；B.各樣本circRNA譜系聚類分析圖，每列代表每個組織樣本的表達(dá)情況，每行代表每個circRNA,紅色表達(dá)高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)
圖2circRNA芯片檢測結(jié)果
Fig2ResultsofcircRNAchiptest

A.qPCR 檢測結(jié)果，bP<0.01，ΔCt值高表示表達(dá)量低；B.hsa_circ_0023397的ROC曲線(P<0.01)
圖3hsa_circ_0023397在活動期CD患者病變腸道黏膜組織和健康對照兩組中的表達(dá)水平
Fig3hsa_circ_0023397expressioninintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols

2.3　自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)檢測

2.4　CD相關(guān)基因ATG16L1蛋白的表達(dá)檢測

利用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，在活動期CD患者腸黏膜中ATG16L1蛋白較健康對照組表達(dá)下降(P<0.05)(圖5)。

圖4活動期CD患者和健康對照腸黏膜中LC3蛋白的表達(dá)(aP<0.05)
Fig4ExpressionofLC3proteininintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols(aP<0.05)

圖5活動期CD患者和健康對照腸黏膜中ATG16L1蛋白的表達(dá)(aP<0.05)
Fig5ExpressionofATG16L1proteininintestinalmucosatissuesofpatientswithactiveCDandhealthycontrols(aP<0.05)

3　討　　論

[參考文獻(xiàn)]

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[15] SALZMAN J,GAWAD C,WANG P L,et al.Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types[J].PLoS One,2012,7(2):e30733.