生物技術(shù)在脂肪酶生產(chǎn)中的應(yīng)用

徐鎖玉

（江蘇旅游職業(yè)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225000）

脂肪酶，又稱三酰甘油酰基水解酶，是一類能催化天然油脂水解生成甘油二脂、甘油單酯、甘油和游離脂肪酸的酶，也是一類能催化酯類化合物合成、酯交換等反應(yīng)的酶，普遍存在于動植物、微生物中，是一種重要的生物催化劑。關(guān)于脂肪酶最早的報(bào)道，要追溯到1834年兔胰脂肪酶活性的研究。這些年來，研究者對脂肪酶進(jìn)入了深入研究。目前，脂肪酶及酶制劑已被廣泛應(yīng)用于食品加工、制藥、污水處理等行業(yè)。

動植物原料提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法是脂肪酶的制備方法。提取法是以富含脂肪酶的動植物組織為原料進(jìn)行提取，該法分離提純工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低。化學(xué)合成法是在分析酶的氨基酸組成順序的基礎(chǔ)上再化學(xué)合成，此法成本高。生物發(fā)酵法是指通過人工控制微生物生長繁殖而獲得酶，受環(huán)境影響小、資源充足、生產(chǎn)脂肪酶的酶周期短，效率高、生產(chǎn)成本低，此外，微生物脂肪酶的作用酸堿度區(qū)間、溫度范圍以及底物專一性比動植物脂肪酶的優(yōu)勢更明顯，故該種酶的應(yīng)用前景也最為光明。當(dāng)下市售商品化脂肪酶主要源于各種微生物的發(fā)酵培養(yǎng)。近年來，國外學(xué)者在產(chǎn)脂肪酶菌種的篩選與分離、發(fā)酵條件的控制等方面做了大量研究，為微生物脂肪酶的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 脂肪酶生產(chǎn)菌的篩選與分離

脂肪酶在微生物中普遍存在，有65個屬的微生物生產(chǎn)脂肪酶，包括28個屬的細(xì)菌、4個屬的放線菌、10個屬的酵母菌、23個屬的其他真菌。

微生物脂肪酶的生產(chǎn)主要有固、液兩種發(fā)酵法。固態(tài)發(fā)酵（SSF）主要采用來源于工業(yè)三廢、植物油加工廠、牛奶加工廠等的霉菌（酒曲菌屬、曲霉、青霉菌、地絲菌數(shù)、毛霉菌屬、根毛霉屬等）生產(chǎn)。Santis-Navarro等利用植物油廢棄物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶，發(fā)現(xiàn)在4.5L反應(yīng)罐中高溫（溫度高于45℃）固體發(fā)酵發(fā)酵20天，能獲得活力120000UA/g的脂肪酶[1]。

液態(tài)發(fā)酵（SME）法主要利用的是細(xì)菌、酵母菌及少部分霉菌。其中細(xì)菌主要是桿菌屬：枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、噬堿芽孢桿菌、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、芽孢桿菌、假單胞菌伯克氏、色素細(xì)菌；酵母菌：皺褶假絲酵母、膠紅假絲酵母、熱帶假絲酵母、柱狀假絲酵母、畸形假絲酵母、南極假絲酵母、木糖畢赤酵母及星狀毛孢子菌等。ThiagoA.Marques[2]等利用一種新型康氏木霉液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶，脂肪酶的活性最高能達(dá)108.7U/mL。MarimuthuKrishnaveni從土壤樣品中篩選出了可以產(chǎn)生脂肪酶的金黃色葡萄球菌MTCC10787，該法經(jīng)濟(jì)高效[3]。

2 脂肪酶生產(chǎn)條件研究

發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶，除了篩選出高效產(chǎn)脂肪酶的菌株，其生產(chǎn)條件也很重要。生產(chǎn)條件主要包括培養(yǎng)溫度、pH、溶氧及培養(yǎng)基組分。其中培養(yǎng)基類別往往決定了組分種類、含量。培養(yǎng)基一般分人工合成、天然和混合培養(yǎng)基。人工合成培養(yǎng)基成分明確，天然培養(yǎng)基一般為工業(yè)、農(nóng)業(yè)殘余物。混合培養(yǎng)基是前兩者混合。WaelAbdelmoez用油脂化工廢棄物做培養(yǎng)基，通過皺褶假絲酵母ATCC 14830液態(tài)深層發(fā)酵制得脂肪酶，活性最高能達(dá)10 U/mL[4]。

為考察溫度、pH、溶氧及培養(yǎng)基等因素對脂肪酶生產(chǎn)的綜合影響，研究者一般經(jīng)單因素、正交試驗(yàn)及響應(yīng)面等統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以提高脂肪酶產(chǎn)量。Chien-Hung Liu等[5]研究了影響伯克氏菌屬發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的因素，發(fā)現(xiàn)當(dāng)曝氣量從0.5調(diào)節(jié)到2時，能使脂肪酶生產(chǎn)速率從0.057提高至0.076 U／（ml·h），由此可見溶氧量增加會促進(jìn)脂肪酶的生產(chǎn)。RafaelResendeMaldonado等[6]考察了溫度、初始pH、蛋白胨和豆油濃度對地霉菌產(chǎn)脂肪酶的影響，得到最優(yōu)條件為溫度30℃、初始pH7.0、3.0%蛋白胨、0.5%豆油，此時產(chǎn)量16U/mL。G. Kishan[7]對解脂假絲酵母生產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基的關(guān)鍵成分進(jìn)行了正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)表明麻花含量6.0%、葡萄糖2.0%、MnCl20.2% 和KH2PO40.2%時，得脂肪酶的最大生產(chǎn)量9.40U/mL。ChristinaPapagora等[8]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了德巴利酵母菌體外生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基成分，發(fā)現(xiàn)酵母提取物5.0%、蛋白胨10%、K2HPO44.0%、MgSO4·H2O 1.0%、葡萄糖13.1%、橄欖油19%、pH值6.4為最佳條件，此時脂肪酶活7.44 U/mL，比之前高 2.28倍。Mar? a Guadalupe Sanchez-Otero[9]利用響應(yīng)曲面法顯著改善了地芽孢桿菌CCR11生產(chǎn)脂肪酶的效率，得出營養(yǎng)肉湯的最優(yōu)濃度3.8 g/L和最佳溫度39.5℃。再經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)最優(yōu)條件下脂肪酶的產(chǎn)量達(dá)到（2283.70±118.36）U/mL，比未優(yōu)化前高6.7倍。

3 其他提高酶產(chǎn)量的生物學(xué)方法

提高脂肪酶產(chǎn)量的方法，除優(yōu)化生產(chǎn)過程的培養(yǎng)條件，還可采用其他手段，譬如誘變育種、異源表達(dá)、定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等。

3.1 誘變育種

高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)酶菌株逐漸成為其應(yīng)用研究開發(fā)的關(guān)鍵。除尋找天然優(yōu)質(zhì)菌株，誘變育種也是一種有效手段。誘變育種是用物理或化學(xué)誘變劑處理菌株提高其突變率，再篩選出少數(shù)滿足要求的突變株。誘變劑主要有亞硝酸、紫外線、亞硝基胍、快中子、硫酸二乙酯等，正突變篩選劑一般有溴化乙錠、膽鹽、克霉唑、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、丁酸、三丁酸甘油酯和己酸等。此法一般可將脂肪酶產(chǎn)量提高10倍左右，最大可達(dá)40倍。楊帆等用紫外誘變了從深海環(huán)境中篩選一株產(chǎn)低溫脂肪酶菌株，在誘變劑量81%時，得到一株能穩(wěn)定遺傳的正突變株UM3，此時酶活達(dá)2540～2710 U/mg，比原始菌株提高34%～39%[10]。

3.2 異源表達(dá)

異源表達(dá)是指將某來源的脂肪酶基因在另一生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)表達(dá)，常見于在微生物及病毒中的表達(dá)。郭勇亮將米根霉基因組作為模板，參照NCBI公布的米根霉脂肪酶基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，試驗(yàn)后得到編碼米根霉脂肪酶前導(dǎo)肽序列及成熟序列的基因——ProROL，在此基礎(chǔ)上，展開pPIC9KProROL質(zhì)粒的構(gòu)建，線性化后電轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母菌株GS115，最后再經(jīng)過嚴(yán)格篩選，成功得到陽性重組菌。搖瓶及7 L罐發(fā)酵結(jié)果顯示，以p-NPP為底物，搖瓶誘導(dǎo)3.5天后上清液酶活為10.6 U/mL。實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的高效異源表達(dá)[11]。王建榮等[12]利用同源克隆法獲得了門多薩假單胞菌P10脂肪酶基因的全長序列，經(jīng)檢測表明，該基因的DNA全長序列為801bp，編碼267個氨基酸，經(jīng)推測，這是一種相對分子量為29.95kU的蛋白。然后再通過將該脂肪酶基因連接到pPICZαA載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X-33中。脂肪酶基因在畢赤酵母X-33中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，搖瓶發(fā)酵液上清酶活最大可達(dá)8U/mL。

3.3 定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變指通過PCR等手段定向改變目的DNA片段，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。較之化學(xué)突變和自然突變，定點(diǎn)突變具有突變率高、重復(fù)性好的等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于酶性能的改善。為獲得耐熱型PLD，JasminaDamnjanovic等[13]嘗試了定點(diǎn)突變組合突變體的高通量篩選方法。采用在鏈霉菌屬PLD特定的氨基酸位點(diǎn)引入隨機(jī)突變的方法，篩選獲得熱穩(wěn)定性最好的D40H/T291Y突變體，試驗(yàn)表明：較之野生型，該突變體的酶活在65℃條件下的半衰期更長。

3.4 定向進(jìn)化

酶的體外定向進(jìn)化是人為地有計(jì)劃地通過突變和體外重組酶的基因進(jìn)而得到高性能脂肪酶的方法[12]。較之自然進(jìn)化，定向進(jìn)化法只作用于突變后的分子群，更有計(jì)劃與目的性。然而保證基因突變庫的豐富性與多樣性是該方法成功的前提，再者還依賴于合適的篩選壓力及高靈敏度高通量的篩選檢測技術(shù)。劉浩[14]等對圓弧青霉堿性脂肪酶I（PCL）進(jìn)行了定向進(jìn)化，通過重疊PCR和易錯PCR技術(shù)，最終得到兩株熱穩(wěn)定性明顯提高的變異體L41P和G47I。

4 展望

21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，脂肪酶的生產(chǎn)也要依靠于生物技術(shù)。要將更多先進(jìn)的生物技術(shù)運(yùn)用到脂肪酶的生產(chǎn)、應(yīng)用研究中，不斷改良菌株，提高酶活，提升酶特性，是今后的發(fā)展方向。