根霉透析膜培養技術及其應用

張素琴，司會

（蘇州農業職業技術學院，江蘇蘇州 215008）

在舊時制曲中，根霉的培養多采用固體傳統培養方法，根霉接種在含水量不超過60%的固體基質上進行生長繁殖，固體基質既是根霉生長代謝的碳源，又是微生物生長的微環境[1]。這種方法雖然工藝簡單，設備可因陋就簡，在我國已沿襲千年之久，但生產效率低、勞動強度大、產品質量不穩定。20世紀70年代，上海工業微生物研究所和上海藕粉廠聯合推出液體培養根霉，實現了工業化、連續化生產，但液體深層發酵工藝要求高，操作尤其嚴格，設備投資一次性較大，難以掌握推廣[2]。20世紀80年代，蘇州市第二米廠采用液、固結合法培養根霉，節省了菌種，擴大了生產規模。為提高生產效率，克服根霉在固體培養、液體培養中的不足，借鑒無土栽培蔬菜的原理，經過不斷探索和試驗，提出了根霉透析膜培養技術，該方法兼具固、液體培養各自的優點，同時又避免它們的某些缺陷，實際上是固態培養、液態培養的折中法[3]。所謂透析培養是通過透析膜調節物質轉移而進行的微生物培養方法，在培養單菌種時，則在兩相的一方培養微生物，另一方則作為培養基貯槽，營養物質的擴散和生物量的累積是在兩相之間的透析膜上進行的，其優點是可以增加生物量的積累，達到很高的細胞密度，同時可節省培養基原料，提高菌體收率。微生物的透析膜培養技術在國外已有數十年歷史，在我國還鮮有報道，尚未有專題研究，現將根霉透析膜培養技術試驗成果和應用價值報道如下。

1 根霉培養特性的研究

根霉在固體培養基上進行無性繁殖過程，孢子發芽長出芽管，接著伸出絮狀菌絲，在營養豐富的麥芽汁瓊脂斜面培養基上，菌絲沿斜面表面蔓延伸展，匍匐菌絲粗壯發達，形成較厚的膜層，菌落初為白色透明，老熟后仍呈白色。在菌絲布滿斜面后，在沿試管壁靠近培養基處，會有少許菌絲沿管壁攀爬伸展，因此可以推斷在試管壁上能夠沿伸生長的菌絲體，是依靠扎根在培養基內的基內菌絲輸送營養。

根霉在液體培養基內是由兩個生理上不同而且有一定親和力的菌絲結合在一起，形成初生配子囊，吸收養分，逐漸成熟形成結合體新細胞，再進行繁殖，即為有性繁殖。此外，初生菌絲體延長，被攪拌斷裂后又延伸生長，液體培養收率高，生物量高于固體培養，但工藝要求高。實驗發現，在三角搖瓶液體振蕩培養中，因振蕩被甩到瓶壁上的菌液仍能沿瓶壁生長，形成菌膜。

通過以上兩個試例可以了解根霉菌絲體在固體表面上生長迅速，有較強的攀爬延伸能力，形成菌絲體膜層，這就為透析膜培養打下基礎，應用透析膜培養技術可以將固、液體培養整合在一起，放在一個環境中進行。

2 根霉透析膜培養原理

利用透析膜將兩相隔開，方法是在液體培養基上放置一塊透析膜，微生物點種在透析膜上，營養物質經擴散滲透至透析膜，而微生物通過透析膜吸取營養，在膜固體表面上生長延伸，累積生物量，即營養依靠液體輸運，而菌的培養生長則在膜固體表面上進行，將液、固培養有機結合。

3 根霉透析膜培養方法

3.1 材料

根霉M101（上海工業微生物研究所）、麥芽汁（自制，大麥發芽，搗碎，糖化，去渣，過濾沉清，調整濃度為14°Bé）、再生纖維素透析膜、500 mL克氏瓶。

3.2 方法

另裁剪一塊比克氏瓶底面積稍大的纖維素膜作為透析膜，取500 mL克氏瓶，裝液量約60 mL作為培養基貯槽，高壓滅菌后備用，滅菌后將其平鋪在滅菌的克氏瓶培養液表面，然后將根霉菌點接種在透析膜上，共接5個點（平均分布），塞上棉塞，此時營養物質以擴散方式滲透通過透析膜供微生物生長需要。

3.3 培養

置32 ℃的恒溫箱中培養36 h，菌絲布滿整個透析膜，培養結束。

3.4 菌絲收率的檢測

取一塊濾紙稱重，記錄原始重量（a），收集刮下附在透析膜上的菌絲體，放在濾紙上，稱重，記錄此時重量值（b），然后置在80 ℃的干燥箱中烘干至恒重，記錄此時的重量值（c）菌體濕重=重量b-重量a，菌體干重=重量c-重量a。

4 結果

培養8 h后可見在原接種點上有微小菌絲長出，之后逐漸長大，菌絲呈放射狀沿膜表面伸展蔓延，菌落呈白色，至28 h后，原5個接種點長成的菌落彼此被聯在一起，形成較厚的膜層，此時根霉生長處恒定期，生物量達最大，可以收獲。菌絲經洗刮，稱重，干燥處理，可得50 mL培養液菌體濕重10 g，干重2 g。

5 應用

5.1 直接用于釀酒

將菌絲體搗碎，以0.1%的接種量，拌入蒸熟的米飯中，32 ℃發酵培養，36 h后釀物成熟，釀成的甜酒釀口感鮮甜，露汁清亮，糖度均可達34°～36°。

5.2 作為種子使用，用于制曲

菌絲體搗碎兌水拌入滅菌的米粉中，按制曲工藝流程，制成的塊曲、散曲產品質量都可達到和超過傳統工藝方法制成的曲。

5.3 制成純根霉制品

菌絲體加入填充料直接干燥脫水制成純根霉菌體，塑料袋包裝，在常溫下貯藏半年，經檢驗根霉菌活力仍能保持原樣，并未有減退。

6 討論

6.1 透析膜的作用與選擇

透析膜除可作為隔開相鄰兩相，以及調節營養物質的轉移輸送之外，也是根霉菌絲體賴依在固體基質上生長沿伸的支撐基料，是一種固體基質，膜的選擇應考慮不被微生物分解和能耐蒸汽滅菌，因此膜應有一定的強度并且廉價易得。

6.2 麥芽培養基濃度的影響與作用

依據根霉的培養特性，有些根霉在老熟后會產生濃密的黑孢子，這對釀酒會產生負面的觀感，因此應盡量選用產黑孢子少的菌種[4]。試驗中發現提高麥芽汁培養基的濃度，可以防止根霉黑孢子的產生，這點可以在生產中推廣、應用。

6.3 透析膜培養技術的作用與應用前景

提高原料收率是制曲追求的目標，即單位重量的原料應能盡可能產生收獲更多的菌絲體生物量，比較各種制曲培養方法認為運用透析膜培養技術可以增加提高菌體的密度，最終可提高特定產物的再生產率。目前膜技術培養已首先在動物細胞生產干擾素，單克隆抗體等方面獲得了應用，根霉的透析膜培養技術經過縝密的試驗后，如能在實踐中加以推廣應用，這將徹底打破我國酒藥生產，藥拌草藥，以及定時定節，固體傳統培養作坊式生產的模式。