植物源殺蟲劑發展新方向

葉 萱 編譯

(上海市農藥研究所，上海 200032)

植物通過基礎代謝作用能合成許多化學物質，其中大部分是植物生長、發育和繁殖等重要功能所需的物質，但有一小部分為次生化合物途徑的底物。在這些化合物中，一些類別在適應環境和防御機制中具有一定作用而值得關注：蛋白質化合物和次級代謝物。植物會因多種因素產生這兩類物質。作為植物構成物質，它們能夠降低植物組織的適口性或使取食生物中毒；作為誘導性物質，在植物組織遭受危害時，植物合成這些物質。從進化的角度看，這些化合物與植物成功抵御昆蟲危害的保護機制有緊密的關系。因此，這些化合物對許多害物有毒，是防治害物潛在的方法。

人類使用植物和植物產品防治害蟲和微生物的確切時間已無法知曉，但與農業生產有久遠的關系。最初簡單、直接地應用植物防治害物，隨著知識的擴展和經歷不同的文明，在19世紀前，開始應用植物提取物為農藥。同時期，對一些植物次生化合物進行了鑒定和表征，近而用于趨避劑和殺生劑，主要為煙堿和其同分異構體假木賊堿等生物堿。但是其他兩個重要類別化合物改變了天然化合物的合成之路，開始了天然化合物啟發的農藥研發之路。這兩類為魚藤酮和除蟲菊酯。

一直到二戰，植物源農藥被廣泛用于農業害蟲的防治。然而，在20世紀30年代末，植物源農藥被合成有機化合物取代，這些物質持效期長，選擇性小，如六六六(C6H6Cl6)、滴滴涕(C14H9Cl5)、艾氏劑(C12H8Cl6)、狄氏劑(C12H8Cl6O)和氯丹(C10H6Cl8)。此后有機氯農藥在農業中一直占據主導地位，直到20世紀70年代農場工人急性中毒、地下水污染、野生動物的死亡、傳粉媒介受到影響和昆蟲抗性的產生等許多事件的出現，引起人們對農藥選擇性和在環境中的持效性的關注。

自此以后，全球對農藥對人畜健康和環境影響的關注不斷增加對合成殺蟲劑使用的行政管理和和限制。目前是重新評估植物殺蟲劑的恰好時機，植物源殺蟲劑受到科學巨大進步的影響，在過去20多年中有關植物提取物防治節肢動物的文獻量大量增加。本文對使用最廣和最有發展前景的植物源殺蟲劑進行收集和分類。介紹了一些商業化防治害蟲的植物化學物質類別，也討論了作為植物部分防御機制的蛋白質化合物。雖然對這些蛋白質化合物進行了大量研究，但仍沒有有效地應用于田間。

1 次級代謝產物

次級代謝產物可作為趨避劑、取食抑制劑和毒物有效防治植食性昆蟲。這類植物化學物質被廣泛用于作物保護直到20世紀40年代有機氯農藥的登場。現在這些物質主要用于有機農業中，但仍是生物勘探新分子的重要途徑。事實上，已對許多植物品種的殺蟲特性進行了篩選，文獻也報道了大量的具有生物活性的化合物，然而，其中很少的物質被適當地測試，現在只有4個有效商業化的植物源產品：除蟲菊酯、魚藤酮、印楝素和精油。表1列出了過去10年商業化的主要活性物質。自此以后，全球市場沒有發生大的變化，部分原因是為天然產品申請專利有很大的難度。

從經濟角度看，除蟲菊酯代表最重要一類商業化植物源殺蟲劑。通常從除蟲菊(Chrysanthemum cinerariaefolium)的花提取，此植物的活性化合物是1類結構相似的酯。除蟲菊酯I含量最大，也是殺蟲活性最高的成分(圖1A)。已知除蟲菊酯具有擊倒作用，作用于昆蟲后，昆蟲先過度興奮，而后麻痹死亡。這是由于除蟲菊酯作用后，昆蟲的神經細胞膜內的鈉離子通道打開而引發的癥狀。純除蟲菊酯對哺乳動物具有中等毒性(LD50～350～500 mg/kg)，但商業化產品(有效成分約25%)毒性低(約1 500 mg/kg)。然而，除蟲菊酯特別不穩定，在紫外光下極易分解。一些研究表明在田間除蟲菊脂的半衰期約為2 h，這大大限制了其防治農業害蟲的應用。盡管如此，除蟲菊酯仍然列于植物源殺蟲劑的首位，在全球銷售用于家庭園藝和花卉植物栽培中的害蟲管理。

表1 商業化植物源殺蟲劑中的主要次生化合物和官能團

圖1 A)除蟲菊酯I的三維結構和分子式，B)魚藤酮的三維結構和分子式

魚藤酮為熱帶豆科植物根或根莖產生的異黃酮類物質(圖1B)。它們是毒性極高的次生化合物，抑制昆蟲的食欲，致其數小時或數日內死亡。在67種以上豆科植物中這些物質的含量豐富，且由其開發了一個廣譜非內吸殺蟲劑，用于防治蚜蟲、薊馬和刺吸式害蟲。此化合物的作用機制不同于除蟲菊酯，其作用于線粒體，阻斷了從復合體I鐵硫中心到輔酶Q的電子轉移，阻礙了能量的(ATP)生成。魚藤酮作為殺蟲劑，是胃毒劑，通過昆蟲的攝入才能起作用。此外，魚藤酮的降解非常快，但持效期比除蟲菊酯長，在空氣和日光中為3～4 d。在近20年魚藤酮商業化用于有機農業，然而，在近年，一些研究表明急性暴露于大鼠，可產生相似于帕金森的大腦損傷，這使有關許多天然產品使用的生物安全標準的建立減慢了。

另一次生化合物類別印楝素是檸檬苦素類物。其分子機構復雜，作用譜廣，對550種昆蟲有生物活性，主要為鞘翅目(甲殼蟲、象甲)、網翅目(蜚蠊)、雙翅目(蠅)、半翅目(臭蟲)、同翅目(蚜蟲、蜂和螞蟻)、等翅目(白蟻)、鱗翅目(蛾類)、直翅目(蝗蟲)、隱翅目(蚤)和纓尾目(薊馬)。此物質根據印楝樹命名，在印度幾個世紀用于抗菌劑和殺蟲劑。

商業印楝素為胃毒劑，但高劑量使用時，也常會有觸殺毒性。報道直接用于地面或注射入植物莖桿，也有內吸作用。不過，印楝素作用特性會根據昆蟲的發育階段、季節和天氣條件的不同發生變化。在暴露后，印楝素可能立即抑制昆蟲的食欲，以及具有內吸中毒和抑制蛻皮活性；也可延遲甚至阻礙昆蟲胚后發育，出現產卵缺陷，不育，抑制酶和幾丁質合成。目前，有2類商業化的植物源農藥印楝素：冷壓種子直接得到的油對軟體昆蟲有效；具有較高活性的用水醇提取的種子提取物，三萜類印楝素A為活性物質。印楝素有許多類似物，而印楝素A和其他少量的化合物的復雜混合物共同起作用，且難以提取。雖然對哺乳動物(LD50＞5 000 mg/kg)、魚和傳粉昆蟲無毒，印楝素對天敵的影響變化很大，需要特別注意。一些田間試驗表明印楝素在日光照射下持效期約20 h，對于某些作物，印楝素可能具有內吸作用，在田間的持效期增加。

由于詳盡登記程序的豁免，原材料豐富且容易獲得，活性成分的成本相對低等原因，最近許多公司在商業開發精油殺蟲劑。精油是通過水蒸餾芳香植物葉片、花或果實獲得的一小部分物質。精油一般是由50多種化合物(常見的化合物見圖2)組成的復雜混合物，可能含有單帖、倍半帖烯、乙醇、酮、醛和酚，通常約12個主要化合物的含量占90%。從結構來看，帖烯常見的特征為其烴骨架，此結構賦予了主要與蛋白失活和抑制酶活性的疏水性，典型的例子為乙酰膽堿酯酶。

精油防治昆蟲的活性直接與其化學成分有關，其次與作物種植和環境條件有關。這些情況使標準化大規模生產和實驗室試驗的再現性相當難。然而在20世紀90年代人們對精油的興趣日益高漲，大量的試驗表明其對許多害蟲具有熏蒸和觸殺活性。雖然天敵經直接接觸對精油敏感，但捕食者和寄生者經殘留接觸不會有中毒風險。

圖2 商業化殺蟲劑精油的最主要活性化合物的三維結構

2 蛋白質化合物

2.1 源于植物的殺蟲肽

2.1.1 環肽

對源于植物的殺蟲肽類物質，人們對其中的環肽很是關注。這類頭尾相連的環肽在堇菜科、茜草科和葫蘆科植物中廣泛發現。根據環肽骨架的loop 5中順式脯氨酸模體的存在(M?bius)或缺少(bracelet),環肽被分為2類：即M?bius和bracelet。從結構上看，環肽一般由27～37個氨基酸殘基形成扭曲的三鏈β折疊，環骨架和稱為半胱氨酸結(CCK)中的3個二硫鍵起穩定作用(圖3A)。在半胱氨酸結中由Cys1-Cys4和Cys2-Cys5形成的二硫鍵以及相連的骨架片段，穩定嵌入環，而第3個Cys3-Cys6二硫鍵穿過此環(圖3A)。此獨特的結構特征不僅可用于區分環肽和從細菌、植物和動物中發現的其他圓型蛋白，而且使其額外穩定，不易被酶降解，不受溫度變化和化學物質的影響。由于這些特性，已評估環肽的抗細菌、殺線蟲和殺蟲的生物功能。

害蟲防治受到極大的社會和經濟關注。為了增加作物的生產效力，已開發了多種防治害蟲的方法，其中包括環肽的應用。Jennings等人研究表明kalata B1(茜草科耳草屬Oldenlandia affinis中含量最豐富的環肽之一)除了具有抗微生物活性，也能抑制危害番茄、玉米和煙草的鱗翅目害蟲——澳洲棉鈴蟲(Helicoverpa punctigera)幼蟲的生長和發育。他們發現用含有kalata B1人工飼料飼喂的50%幼蟲在處理后16 d死亡。此外，50%存活的幼蟲在1齡期發育受到抑制，而對照能正常發育到第5齡期。

圖3 A)從Oldenlandia affinis分離得到的環肽家族成員kalata B1的三維結構和表面靜電勢(PDB編碼：1nb1)，箭頭指示為二硫鍵；B)從豌豆分離得到的PA1b的三維結構(PDB編碼：1p8b)，表面電勢計算中標出了參與PA1b疏水補丁形成的殘基(Phe10、Arg21、Ile23和Leu27)，用箭頭標出了二硫鍵；C)從綠豆分離得到的防御素家族成員VrD1的三維結構和表面電勢

1年后，Jennings等人評估了kalata B1和B2對棉花主要害蟲棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的生物活性。從O. affinis分離、純化得到Kalata B1和B2，二者的不同為5個氨基酸取代物不同，但都具有1個保守的折疊。以植物的濃度水平，把kalata B1和B2都加入人工飼料中。試驗結果表明二者對棉鈴蟲幼蟲的致死率分別為20%和28%，幼蟲的體重分別為對照的1/3和1/4。

最近，Pinto等人從茜草科Palicourea rigida發現了一個新穎的bracelet類成員，即parigidin-br1。評估了parigidin-br1對重要的甘蔗害蟲小蔗螟(Diatraea saccharalis)的殺蟲特性，結果表明以1 μM處理后15 d初孵幼蟲的死亡率為60%，與對照相比幼蟲體中減少46%。有趣的是，Pinto等人也發現paridigin-br1以劑量依賴式(1、5、10 μM)抑制常危害玉米和棉花的鱗翅目害蟲草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆蟲細胞系(SF-9)，這表明環肽對昆蟲具有離體和活體活性。

2.1.2 豌豆白蛋白1b(PA1b)

除了環肽外，抑制劑半胱氨酸結(inhibitory cysteineknot，ICK)家族的一個成員，豌豆白蛋白1b主要對米象(Sitophilus oryzae)、谷象(Sitophilus granarius)和玉米象(Sitophylus zeamays)具有殺蟲活性，也引起人們的關注。PA1b從豆科植物(例如豌豆)種子中提取，為1個含有37個氨基酸殘基的富含半胱氨酸的肽，由PA1基因編碼，翻譯后修飾產生2個成熟的肽PA1a(6 kDa)和PA1b(3.8 kDa)。有趣的是，對豌豆中編碼PA1b同源物的數個核苷酸序列研究表明此類殺蟲肽具有多基因特性。從結構上看，PA1b為與彈性loops相連，3個二硫鍵穩定的三鏈反向平行β-折疊(圖3B)。和環肽一樣，在不考慮其環骨架的情況下，此結構排列也賦予PA1b耐酶降解性和熱穩定性，此特性支持PA1b是目前所知的很少的經口活性肽之一。除了knottin折疊，PA1b表面具有靜電性和兩親性(圖3B)，與來自漏斗網蜘蛛(Hadronyche infensa)的蜘蛛毒素ACTX-Hi:OB4219的相似，表明此物質具有阻礙通道活性，分別來自中華鱟(Tachypleus tridentatus)和垂序商陸(Phytolacca americana)的抗微生物和抗真菌的蛋白tachystatin A和PAFP-S也具有此情況。

一些研究已評估了PA1b的殺蟲潛力，表明其具有殺滅米象、谷象和玉米象等谷物象甲和尖音庫蚊(Clulex pipiens)和埃及伊蚊(Aedes aegyptii)等人類疾病傳播媒介的作用。另一方面，好像PA1b對棉夜蛾(Spodotera littoralis)和歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)等其他農藝重要毛蟲沒有活性，表明PA1b的毒性活性和昆蟲科沒有相關性。為了弄清PA1b的作用機制，da Silva等人評估了取代單個殘基的影響和PA1b對敏感和抗性米象品系以及SF9昆蟲細胞的活性。在此研究中，得到13個PA1b突變體，其中與PA1b的兩親性/靜電性(Phe10、Arg21、Ile23和Leu27)有關的殘基被丙氨酸取代。結果，發現受體結合和殺蟲活性與PA1b一面的理化特性的保持有本質的相關性，對PA1b表面暴露的疏水補丁(hydrophobic patch)修飾導致離體和活體殺蟲活性的顯著下降或喪失。也好像即使生物活性減少或沒有，缺少Phe10、Arg21、Ile2和Leu27的突變體能保持野生型PA1b折疊和對降解有耐受性，再一次說明疏水補丁對PA1b殺蟲活性的重要性。主要通過化學分析和對這些肽的離體折疊研究了PA1b突變體和異構體。然而，最近的研究表明通過農桿菌滲入法(Agroinfiltration)PA1b和其類似物能夠在本氏煙中異源表達，且能以最大量產生8 d。此策略已能使生物活性PA1b異構體成功大量表達，表明PA1b在農用工業可有多種用途。

2.1.3 防御素

除了上面提到的CCK和ICK殺蟲肽外，已知的γ-硫堇蛋白防御素為富半胱氨酸家族，由45～54個氨基酸組成的堿性肽。已確定豌豆、蘿卜和大麥等一些植物組織中的此家族的成員。已有文獻詳盡地介紹了防御素的三維結構，除了PhD1外，其他防御素的CSαβ模體中含有1個α-螺旋和被4個二硫鍵穩定的三鏈反平行β-折疊，一共有5個二硫鍵。除了二硫鍵中的8個高度保守的半胱氨酸殘基外，防御素家族成員也共有其他重要殘基，包括Gly13、Gly34和Glu29，以及11位的1個芳香族殘基。此外，這些保守殘基側面區域可能變化大，這可能是防御素呈現多種生物活性的原因。如已發現的抗細菌、抗真菌、殺蟲，抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性。

Chen等人報道了對綠豆象(Callosobruchus chinensis)有殺蟲活性的植物防御素。在此研究中他從抗豆象的綠豆中分離和過度表達(不同體系)了編碼新穎防御素的cDNA，命名為VrCRP。評估了含有不同量VrCRP的人工種子抑制綠豆象成蟲出現的活性，結果，含有0.2% VrCRP的種子徹底阻礙了豆象的發育。數年后，此研究團隊也報道了此肽的溶液結構，除了含有半胱氨酸穩定的αβ模體，也具有1個不尋常的310螺旋，此結構可能是由于位置23的精氨酸被保守的谷氨酸取代導致的Thr10位移誘導產生。此外，Chen等人也提出來自綠豆的VrD1通過抑制昆蟲中腸的多糖水解酶而有殺蟲活性，而β2和β3間的loop可能是其結合位點(圖4)。最近，在轉基因作物領域，Choi等人提議在水稻體內表達來自蕪菁(Brassica rapa)的植物防御素BrD1以賦予水稻抗褐飛虱(Nilaparvata lugens)的能力。在生測中發現，表達BrD1的轉基因水稻品系在接種褐飛虱后5 d內能成功地降低若蟲的成活率，與野生敏感對照相比致死率為約78.6%～95.7%。這些數據清晰地表明植物防御素在抗蟲作物的開發中會有很好的前景。

2.1.4 Jaburetox-2Ec：來源于刀豆(CanavaIia ensiformis)的不尋常的殺蟲肽

除了以上提及的肽類，在此部分介紹從刀豆中的脲酶同工酶——刀豆毒素衍生而來的不尋常的肽jaburetox-2Ec的殺蟲活性。研究表明在將刀豆毒素飼喂于產生組織蛋白酶的害蟲秘魯皮蠹(Dysdercus peruvianus)和四紋豆象(Callosobruchus maculatus)試驗中，此物質是有效的殺蟲毒性蛋白。然而，此殺蟲活性是刀豆毒素被昆蟲組織蛋白酶水解產生10 kDa殺蟲肽pepcanatox所致。Mulinari等人介紹了在異源體系(大腸桿菌)產生相當于pepcanatoxde的重組肽jaburetox-2Ec的方法。他們研究表明用含有0.01%(w/w)純jaburetox-2Ec的棉花種子飼喂秘魯皮蠹3齡幼蟲11 d，幼蟲全部死亡。也報道用含有16.3 μM jaburetox-2Ec的飼料飼喂草地貪夜蛾3齡幼蟲2 d，蟲體比對照小20%。此外，草地貪夜蛾幼蟲攝取47 μM jaburetox-2Ec后全部死亡。從結構看，用從頭建模預測jaburetox-2Ec具有1個β-發夾的三維理論模型，成孔肽以及神經毒素也好像具有此結構。

圖4 昆蟲中腸中主要作為拒食劑干擾營養吸收的蛋白質化合物的作用機制

2.2 殺蟲肽酶抑制劑

在蛋白質化合物中，植物肽酶抑制劑(PIs)是在新栽培品種中異源表達的一類有發展前景的物質，是應對昆蟲和植物病原體對當前農藥抗性不斷增加的可靠的替代方法。它們的結構特性決定其主要被1個基因激活，因此進行了PI在轉基因植物中表達的多個研究，以增加作物的抗性。

PIs普遍存在于植物的塊莖和豆科植物的種子中，但也在數種植物的不同組織中發現。雖然還沒有完全弄明白其生理作用，但有證據表明植物以貯存蛋白(一般在貯存組織中達10%)積累PI，PI也被用于應對機械性受傷和機會性侵染。另一方面，PI通過抑制昆蟲中腸中的蛋白酶活性，減少昆蟲生長和發育必須的氨基酸的量，使植物防御植食性害蟲的危害。分子量為3～25 kDa的PI能夠與靶標蛋白酶形成穩定的復合體，阻礙酶到達活性位點。文獻介紹PI能夠作用于4類蛋白酶：絲氨酸、半胱氨酸、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶，因此，在發現有的抑制劑同屬于多個類別之前，一直根據酶抑制劑的催化位點的化學性質對其分類。根據Rawling等人的提議和更新到2007年的植物PI數據庫，至少有16個植物蛋白酶抑制劑類別。其中，Kunitz和Bowman-Birk類別被研究最多，用于防治農業昆蟲和病原菌。表2列出了重要作物中發現的類別。

表2 根據重要作物中序列的相似性對蛋白酶抑制劑家族進行分類

續表

在暴露較多的圍繞P1殘基的loop中的每一抑制域有一反應位點肽鍵，根據位點的數量，可分為簡單抑制劑或復雜抑制劑，也即相應地為同型或異型的；包括修飾的抑制劑，大部分抑制劑含有二硫鍵。除了半胱氨酸-PI和金屬蛋白酶抑制劑外，其他家族可能都含有絲氨酸蛋白酶和另一機械類(methanistic class)蛋白酶，即主要對絲氨酸蛋白酶有活性但也抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的Kunitz類。

Kunitz類蛋白酶抑制劑是廣泛存在于不同植物家族的最大的蛋白酶抑制劑類別，但主要存在于豆科種子中。被純化和表征的第一個植物Kunitz類抑制劑為1945年從大豆獲得的胰蛋白酶抑制劑(大豆胰蛋白酶抑制劑-STI Kunitz)。此家族的成員具有1個典型的構型，能夠與靶標酶形成非常牢固的復合體。絲氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶主要被Kunitz類抑制。植物kunitz類抑制劑含有約180個氨基酸殘基，分子量為18～22 kDa，結構為1個多肽鏈，也稱為“單頭”(single headed)；半胱氨酸殘基含量低(一般4個，Cys39-Cys86和Cys136-Cys145)，參與了1個或2個二硫鍵的形成。一般，Kunitz類抑制劑只有一個反應位點，通常為賴氨酸或精氨酸，但有些抑制劑可能含有另一獨立反應位點。Kunitz類對不同蛋白水解酶有活性，但通常為胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶，因此被認為對未來植物防御昆蟲方面具有很重要的作用。簡而言之，昆蟲攝入此類蛋白酶抑制劑后，中腸中的蛋白酶被完全抑制，使昆蟲對基本氨基酸的吸收下降，直到饑餓而死。最近，許多研究認為表達Kunitz抑制劑的基因的轉基因植物對害蟲和病原菌有防御性。

1946年D.E. Bowman從大豆種子中分離純化得到第一個Bowman-Birk抑制劑(BBI)，1963年Y. Birk對其進行了表征。在數種單子葉和雙子葉植物中可發現此類物質，它們主要貯存在種子中，但也會因傷誘導在葉片中產生。BBI類是富含半胱氨酸的蛋白質，為含有2個反應位點(雙頭抑制劑)的小分子多肽(8～9 kDa)，2個反應位點獨立但同時與同源蛋白酶反應。通常，這2個同源域由1個具有胰蛋白酶反應點的N-末端和與胰凝乳蛋白酶反應的C-末端組成，由7個保守的二硫鍵穩定。核磁共振(NMR)和x射線晶體的研究表明雙頭BBI的2個反應點位于分子的兩端(圖5B)。與胰蛋白的S1點相應的P1殘基為精氨酸或賴氨酸，負責識別活性位點，并與其結合。疏水亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和絡氨酸是與胰凝乳蛋白酶位點結合的臨近殘基，而丙氨酸僅對彈性蛋白酶位點有選擇性。此外，BBI家族含有一個獨特的與二硫鍵連接的含有9個殘基的loop，以類底物方式與蛋白酶結合。

圖5 (A)來源于大豆的Kunitz型抑制劑(PDB編碼：lavw)，(B)來自于豇豆的Bowman-Birk抑制劑(3ru4)，(C)來自于茄子的防御素(5cad)，(D)來自于雪花蓮的甘露糖凝集素(PDB編碼：lniv)

對于其他類PPI，用于轉基因作物提高作物抗植食性害物要更好于直接用于田間。一些研究已表征了編碼Bowman-Birk類蛋白酶抑制劑的基因，目前正在進行一些大田試驗來評估過表達此PI增強作物抗昆蟲的價值。

2.3 殺蟲劑——和幾丁質結合的豌豆球蛋白(7S貯存蛋白)

在20世紀70年代熱帶農業國際研究所確定了對四紋豆象具有高度抗性的第一個基因型豇豆(栽培品種TVu 2027)，并以此栽培品種培育了數個其他的抗性品系。起初，對四紋豆象的抗性被認為與豇豆中表達的高水平胰蛋白酶抑制劑有關。然而，隨后Macedo等人研究表明不同豌豆球蛋白的存在是抗性產生的最可能原因。自此，發現豌豆球蛋白具有多種生物特性，如抗微生物活性、結合蔗糖活性和殺蟲活性。

一般，豌豆球蛋白被描述為不同的7S貯存球蛋白(約20.1～94 kDa，多亞基物)，被不同程度糖基化的多基因家族編碼，通常在豆科植物種子和非豆科植物中發現。已獲得一些豌豆球蛋白的晶體結構，報道主要為被非共價鍵相互作用穩定的三聚體構象。最近，也報道茄子(Solanum melongena)中三聚體豌豆球蛋白的每個單體由疏水和陰離子配體結合口袋2個區域組成(圖5C)。此外，研究已表明這些糖蛋白對水解具有耐受性，說明對幾丁質有很強的親合力，已知幾丁質在數種昆蟲的圍食膜形成中具有重要作用(圖4)(PM)。在此種情形下，已報道豌豆球蛋白與幾丁質結合特性影響了昆蟲圍食膜的滲透性和結構，而可能導致圍食膜的生理機能的改變，因此直接影響幼蟲的發育和存活。此外，由于豌豆球蛋白與含幾丁質的表面的特異性結合，也抑制具有幾丁質細胞壁的酵母細胞。然而，有趣的是，豆象甲蟲(例如四紋豆象)不具有真正意義上的PM，但以圍食膜凝膠代之。在此種情況下，研究已表明7S貯存豌豆球蛋白可能被中腸上皮細胞吸收，近而在血淋巴中以三聚體形式流動，也達到內臟器官，包括脂肪體和馬氏管，導致豆象甲蟲幼蟲生理不穩定。說來奇怪，最近，Alexandre等人發現四紋豆象雄雌蟲脂肪體中的豌豆球蛋白能夠部分地水解為數個片段，最后沉積在這些昆蟲的卵中，成為防御性武器，因此提高四紋豆象幼蟲后代的存活率。

評估了7S貯存豌豆球蛋白對墨西哥豆象(Zabrotes subfasciatus)、小蔗螟、四紋豆象、地中海實蠅(Ceratitis capitata)和印度谷螟(Plodia interpunctella)等許多昆蟲的幼蟲和成蟲的活性。Moura等人研究表明從青皮象耳豆(Enterolobium contortisiliquum)種子(EcV)中分離得到的豌豆球蛋白混入飼料中飼喂四紋豆象和墨西哥豆象幼蟲，LD50分別為1.1和0.43%(w:w)；而使四紋豆象和墨西哥豆象幼蟲體重減少50%的有效劑量(ED50)分別為1.03和0.65%(w:w)。此外，1年后他們報道從Erythrina velutina種子分離的豌豆球蛋白，稱為EvV，對四紋豆象和墨西哥豆象的LD50分別為0.26和0.10%(%，w:w)，以及ED50分別為0.19和0.14%(w:w)。此外，發現處理12 h后，EvV不僅耐四紋豆象和墨西哥豆象幼蟲酶的水解，而且在施用24 h后，耐墨西哥豆象幼蟲酶的水解。在2個研究中EcV和EvV都為耐蛋白水解，能結合幾丁質的蛋白質，表明這些物質可作為新穎的天然殺蟲劑，經胃毒作用防治害蟲。

豌豆球蛋白除具有殺豆象活性，研究也表明來自豇豆的豌豆球蛋白能夠與小蔗螟幼蟲的圍食膜結合，用含有2%(w:w)豌豆球蛋白的人工飼料飼喂，與對照相比成蟲的出現量減少40%。相似地，Macedo等人報道用含有EvV的人工飼料飼喂地中海實蠅，LD50和ED50分別為0.14和0.12%(w:w)，這可能與幼蟲圍食膜中的EvV與幾丁質結合特性和EvV在地中海實蠅消化道中對蛋白酶水解敏感性低有關。同時，他們研究發現把EvV加入人工飼料中飼喂對印度谷螟幼蟲的LD50(致死)和ED50(體重減少)分別為0.23和0.27%(w:w)。然而，在此種情況下，EvV對酶解敏感，能夠產生具有免疫活性和能夠結合到圍食膜基質的數個片段，這表明EvV在鱗翅目昆蟲中腸中被分解后具有不同的作用。

2.4 殺蟲劑——與碳水化合物結合的植物凝集素

植物凝集素，最初被稱為凝集素，由具有至少1個可逆性結合甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖(幾丁質-多聚物)等特異性單-和/或寡糖的非催化區域的各種各樣結合碳水化合物的蛋白質組成。根據整體區域排列，植物凝集素被分為4個主要類別，部分凝集素(merolectins)：只有1個結合碳水化合物的區域；全凝集素(hololectins)：2個或多個具有相同的或高度同源的結構的結合碳水化合物的區域；超凝集素(superlectin)：具有能夠識別結構無關碳水化合物的2個或多個結合碳水化合物區域；嵌合凝集素(chimerolectins)：具有1個或多個結合碳水化合物區域，這些區域與具有額外生物活性的另一區域有關。此外，隨著分子生物學和生物化學的發展，在區域排列知識中增加了序列相似性和進化關系，由此目前把植物凝集素分為12個類別。從結構上看，這些蛋白主要由與loops相連的反平行的β-折疊組成，含有一定的螺旋結構(圖5D)。此外，可能發現被氫鍵、鹽和疏水相互作用穩定的二聚和/或四聚體構型。對于其生物學特性，研究表明植物凝集素對鞘翅目、雙翅目、鱗翅目和同翅目等害蟲具有很好的殺蟲活性。對于其作用機制，已有人提出植物凝集素可能與昆蟲中腸圍食膜相互作用，抑制營養的吸收；結合到中腸上皮細胞上的糖蛋白上，破壞組織(圖4)；干擾昆蟲基因的表達；與靶標昆蟲刷狀緣膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)受體蛋白相互作用；與昆蟲口器區域的感覺感受器上的碳水化合物結合，破壞膜的完整性，影響昆蟲檢測食物的能力。此外，植物凝集素對蛋白酶的降解有高抗作用。

Macedo等人已從不同植物品種開發了具有殺蟲活性的凝集素，能夠防治經濟重要性害蟲。在其研究中，源于欒樹(Koelreuteria paniculata，KpLec)種子和羊蹄甲(Bauhinia monandra，BmoLL)葉的凝集素加入人工飼料飼喂，對四紋豆象的LD50分別為0.7和0.3%(w:w)。然而，只有KpLec對鱗翅目地中海粉螟有活性，LD50為0.65%(w:w)。相似地，Coelho等人報道來自Annona coriacea (ACLEC)的凝集素混入人工飼料飼喂對地中海粉螟幼蟲的LD50為1.5%(w:w)。除了能降低昆蟲幼蟲的存活率，Macedo等人也研究表明Talisi esculenta凝集素(TEL)的殺蟲活性受不同碳水化合物的調節，加入甘露糖后其對四紋豆象的活性完全消失，表明碳水化合物-凝集素與昆蟲消化道中的復合糖相互作用。雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis: agglutinin GNA)等其他植物凝集素被昆蟲攝入后能夠與中腸上皮細胞相互作用，隨后進入血淋巴，由此可對這些分子進行新的生化技術應用。

有趣的是，為了把這些蛋白質用作其他殺蟲分子的載體，已開發了凝集素與簡單和/或復雜碳水化合物反向結合的能力。Fitches等人研究了GNA攜帶和傳遞殺蟲螨毒液神經毒素1(SFI1)到番茄蛾(Lacanobia oleracea)幼蟲的血淋巴中的潛力。結果，他們發現雖然GNA和SFI1單獨對番茄蛾幼蟲沒有急性毒性，但飼喂含有2.5%(w:w)SFI1/GNA結合體的人工飼料6 d后，番茄蛾1齡幼蟲的死亡率為100%。此外，此結合體也引起約90%的第4和5齡幼蟲死亡，且隨著劑量增加，死亡率增加。數年后，他們報道SFI1/GNA結合體對煙蚜(Myzus persicae)和褐飛虱(Nilaparvata lugens)有毒。此發現清楚地表明蛋白質結合體策略可作為替代性方法用于作物保護，用植物凝集素作為載體把毒素傳遞到昆蟲體內的靶標點。

隨著當前基因工程的發展，為提高作物的產量在作物體內表達植物凝集素編碼序列已獲得關注。Dutta等人利用農桿菌轉化法在煙草中首次表達大蒜葉凝集素(ASAL)編碼序列。研究發現表達ASAL的轉基因煙草田中的煙蚜存活率約16%，而對照的約75%。Dutta等人發現與對照相比，表達ASAL的轉基因水稻處理的褐飛虱的存活率和繁殖率分別降為36%、32%，二點黑尾葉蟬(Nephotettix virescens)40.5%、29.5%。有趣的是，Bharathi等人通過穩定表達ASAL和FNA的轉基因水稻間的雜交，逐漸增加水稻中2個凝集素基因(ASAL和GNA)，來進一步研究植物轉化的概念。在此研究中，他們發現進一步雜交的水稻品系被主要刺吸式害蟲危害的程度要輕于其母本轉基因作物，因為其能更有效地降低昆蟲的存活率、取食能力和繁殖力。總的來說，有關植物凝集素的所有這些發現表明這些分子在防治害蟲方面有巨大的發展潛力。

3 新一代植物源殺蟲劑的挑戰和發展前景

雖然文獻對數種植物次生化合物的殺蟲活性進行了較廣泛的介紹，但其中只有一些物質被批準使用和商業化，且主要用于有機農業。從商業化角度看，此類植物藥劑由于缺乏商業化所需的生物活性和防效的標準和技術而受到了限制。植物化學物質的固有特性(作用慢、防效變化大、持效期短)和沒有統一標準的技術是其農業市場進入率低的主要原因。而蛋白類化合物比次生代謝物在環境中更穩定和持效期更長，可利用納米粒子工程化技術優化而更好地被昆蟲攝入和接觸。然而，依靠種植作物來專門提取殺蟲劑的道路還很遙遠，因為這需要在土地和技術上進行巨大的投資。如果能以低成本、高效率容易的合成，特別是預測和合理設計蛋白質結構以增加其生物活性，就可獲得大量的此類物質。

轉基因表達蛋白類化合物可能是增加植物防御能力最可靠的方法。蛋白質化合物由于結構特性，需要把其編碼基因(1個基因)轉入目標植物，在此植物組成型啟動子的作用下表達。此外，植物基因組的轉化作為產生異源蛋白、以植物為離體生物工廠、優化化合物的產出和使可能的環境風險最低化的方式具有很大吸引力。基因工程的另一優勢就是重組基因，作為防御機制直接在作物體內表達的可能性。在近年科學家在基因編碼蛋白化合物，把這些基因轉入作物使作物對害物具有防御能力方面進行了許多研究。最近，CRISPR系統的發現和Cas9用作易重組核酸酶，組成了依靠序列特異性雙鏈斷裂誘導的基因組工程。自此，研究焦點變為誘導許多植物發生NHEJ-介導的遺傳突變，這通過把表達核糖酶的DNA轉入植物細胞獲得，通過隔離不含有轉基因DNA的后代而消除。此新工具已改變分子生物學，開辟了提高植物防御能力的新領域。

從長遠來看，昆蟲抗性可能降低此技術的效果。且殺蟲劑越有效，選擇壓力越大，常導致抗性的快速進化。這與殺蟲劑為化學物還是轉基因植物表達的物質(plant-incorporated protectant)無關。生物進化和獲得抗性是發生在許多環境中的進化機制，并不總是與轉基因生物的出現有關。

大多數的消費者認為植物源產品是用于有機農業，然而，本文認為植物源物主要是植物產生，但可以多種方式開發，能夠用于昆蟲的防治和大規模農業生產中。