免疫球蛋白降低對復發性流產患者NK細胞的療效評價

劉曉麗，鄧飛越，周　楊，黃鍵寧，郭彩霞

(廣州市增城區人民醫院婦產科，廣東 廣州 511300)

目前我國處于社會和經濟轉型期，女性的生育年齡逐漸推后，復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)問題日益嚴峻[1]。越來越多的證據表明免疫因素在RSA的發病機制中起著重要的作用[2]，包括體液因素(如抗磷脂抗體、抗甲狀腺抗體、抗細胞核抗體、免疫球蛋白M升高)和細胞因素(如自然殺傷細胞上升和抑制性T淋巴細胞下降)等，免疫作用對滋養層、胎盤和胚胎產生一定的毒性反應導致流產[3]，其中外周血自然殺傷細胞(natural killer，NK) 細胞數量和活性與不明原因復發性自然流產明顯相關。自上世紀80年代以來，注射用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)一直被用于治療RSA，通常被認為是通過降低NK毒性，使Th1/Th2平衡向Th2發展而發揮作用[4]，但對于NK細胞正常的RSA女性臨床療效目前尚不明確。為進一步明確IVIG對不同NK細胞水平RSA女性的治療效果，本研究納入部分患者進行對比分析，現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年10月至2015年12月在廣州市增城區人民醫院婦產科就診的RSA患者，入選標準：①年齡20 ～40歲；②既往曾連續發生≥3次的無明顯誘因自然流產；③抗磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺微?？贵w等各種自身抗體陰性；④血清IgA水平正常；⑤了解研究內容并愿意配合檢查，簽署知情同意書。排除標準：①激素水平偏低或夫婦雙方染色體異常；②泌尿生殖系統感染或活動性炎癥；③內外生殖系統解剖異?；蚱髻|性病變；④嚴重的心肝腎或血液系統疾病，無法耐受IVIG治療。符合入選標準的患者90例，按NK細胞是否正常分為NK細胞升高組(試驗組，56例)和NK細胞正常組(對照組，34例)，90例患者均順利接受IVIG治療，無1例失訪、中途退出或死亡，所有數據均納入分析。

1.2方法

1.2.1治療方法

試驗組和對照組均給予IVIG(2.5g：50mL/瓶)500mg/kg，靜脈注射，在卵泡期開始治療，滴速控制在75mL/h，1次/月[5]，兩組具體給藥方案見表1。

表1兩組IVIG用藥方法

Table 1 Comparison of IVIG between two groups

組別持續用藥方案成功妊娠者未妊娠者試驗組★第二次用藥前復查NK細胞，仍高于正常值者繼續用藥，如果NK細胞已恢復則暫停用藥定期復查NK細胞，正常者繼續觀察，仍升高者IVIG用法同前療程不超過半年對照組IVIG每月1次IVIG每月1次療程不超過半年

注：★連續兩次復查NK細胞仍為正常者停止用藥，后續再出現NK細胞升高也不給藥。

1.2.2檢測指標

1.2.2.1 NK細胞NK細胞CD16和CD56抗原均有表達，同時CD3抗原陰性，因此CD3-/CD16+56+的細胞才是真正的NK細胞。患者晨起空腹抽取肘靜脈血3mL，常規肝素抗凝后-4℃冷凍保存，使用Ficoll-Hypaque 法離心分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，通過孵育、透化等處理后采用流式細胞儀(型號Biosciences AccuriC6，美國BD公司生產)測定患者NK細胞的范圍。由于淋巴細胞亞群存在種族、性別和年齡差異，目前國內尚無淋巴細胞亞群正常值范圍供參考，因此本研究采用姚春艷等[6]的研究結果(0.78%～11.71%)作為正常值標準。

1.2.2.2妊娠結局 詳細記錄兩組患者的異位妊娠、孕周、分娩方式、胎兒宮內發育、胎兒體重、Apgar評分和并發癥情況。世界衛生組織分娩指導對正常分娩的定義為產婦自產程開始到結束均為低危，胎兒單胎、頭位，在37孕周和42孕周之間自然的發動宮縮，胎兒經陰道自然娩出，產后母親與胎兒情況良好。并強調在正常分娩中，除非有確切必要的理由，不要干涉正常產程的進展[7]。

1.2.2.3不良反應 記錄兩組用藥過程中出現與藥物相關的不良反應(如輸液反應、頭痛)的發生情況。

1.3統計學方法

以SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料使用“Kolmogorov-Smirnov”作正態性檢驗，符合正態分布的數據以均值±標準差描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的數據以中位數(四分位間距)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料以百分率描述，組間比較采用χ2檢驗；均以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1一般情況

兩組年齡、受孕方法、既往孕產次等資料組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，而試驗組NK細胞水平高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2兩組人口學及病情資料組間比較[χ±S,n(%)]

Table 2 Comparison of demographic and disease data between two groups[χ±S,n(%)]

比較項目試驗組(n=56)對照組(n=34)t/χ2/ZP年齡(歲)32．37±5．5330．28±3．323．350．05受孕方式　自然受孕52(92．86)33(97．06)0．710．40　人工受孕4(7．14)1(2．94)既往孕次5(3，7)4(3，6)1．440．48既往產次　未產48(85．71)32(94．12)1．510．22　≥1次8(14．29)2(5．88)NK細胞比例(%)15．53(12．40，17．11)3．38(2．25，6．33)9．33<0．01

2.2妊娠情況

試驗組和對照組各有早產兒3例和1例，剖宮產2例和1例，組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)；兩組均無異位妊娠、胎兒宮內生長遲緩和畸形病例，未出現產后出血、羊水栓塞等并發癥；試驗組妊娠率、正常分娩率均高于對照組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，而流產率低于對照組(P>0.05)，見表3。

2.3不良反應

兩組分別有部分患者出現輸液反應、頭痛和過敏等不良反應，無肝腎功能損害病例，兩組不良反應發生率分別為10.71%和17.65%，組間比較差異無統計學意義(χ2=0.88，P=0.35)，見表4。

表3兩組妊娠情況比較[n(%)]

Table 3Comparison of pregnancy between two groups[n(%)]

比較項目試驗組(n=56)對照組(n=34)χ2P妊娠率49(87．50)11(32．35)28．95<0．01正常分娩率40(71．43)4(11．76)30．14<0．01流產率4(7．14)5(14．71)1．340．25早產3(5．36)1(2．94)0．290．59剖腹產2(3．57)1(2．94)0．030．87

表4兩組不良反應發生率比較[n(%)]

Table 4 Comparison of incidence of adverse reactions between groups[n(%)]

類別試驗組(n=56)對照組(n=34)輸液反應2(3．57)3(8．82)頭痛3(5．36)1(2．94)過敏反應1(1．79)2(5．88)肝腎功能損害00合計6(10．71)6(17．65)

3討論

3.1復發性流產發病機制及治療方法進展

RSA的病因包括夫妻染色體異常、母親生殖器器質性或功能性病變、激素水平改變、環境生活因素、免疫功能和心理因素異常等[8]，其中免疫因素引起的流產被稱為免疫性流產，尤其是對年齡>30歲的女性[7]。年齡是RSA病因劃分的重要因素，年輕RSA女性(<30歲)通常是由于甲狀腺功能異常、基因變異、子宮畸形、血糖異常和吸煙等，而高齡RSA女性(≥30歲)異倍體和免疫功能異常則是關鍵病因，其免疫異常主要表現為Th2細胞比例下降而Th1細胞上升，使機體免疫應答系統從生育模式轉變為病原防御模式[9]。

RSA的治療一直處于爭議狀態，由于狼瘡抗凝綜合征和抗磷脂抗體促進血栓的形成，使用肝素和阿司匹林的抗凝策略曾一度盛行，該療法有效率接近80%，但也導致16%的女性發生出血，甚至出現致死性出血事件[10]。后期研究意識到免疫因素的重要性，免疫調節治療逐漸在臨床普及，但糖皮質激素只對抗細胞核抗體陽性的病例有效率較高，其他類型的RSA無效，而且不良反應相當明顯，甚至可導致胎兒早產[11]。同種異體淋巴細胞免疫治療對部分RSA孕婦有一定效果，但總體有效率仍然偏低，而且有嚴重過敏反應和注射部位瘢痕疼痛的病例報告，目前已經被大多數醫療機構淘汰，現在主要采用患者配偶或健康人群的淋巴細胞進行主動免疫治療和丙種球蛋白被動免疫治療兩種方法[12]。

3.2 NK細胞在復發性流產發病的病理作用

NK細胞是與T、B細胞并列的第三類群淋巴細胞，占外周血淋巴細胞總數的10%～15%，有一定的細胞毒性效應，無需抗原預先致敏就可自發殺傷靶細胞，還可以通過分泌細胞因子發揮免疫調節作用。NK細胞也可能通過產生穿孔素并促進NK細胞活化，參與早產的免疫發病機制[13]。研究表明外周血NK細胞數量上升與RSA相關，無RSA病史的女性血清NK細胞比例為5%～8%，而RSA病史的女性NK細胞比例可上升至9.5%～17%，有研究表明以血清NK細胞的比例(界值為>16.4%)作為妊娠結局的預測指標，預示染色體核型正常的妊娠也可能發生異常妊娠或自然流產[14]。免疫治療可降低RSA患者NK細胞水平，即使使用了肝素、阿司匹林和潑尼松等抗炎藥物，25%～30%的妊娠病例仍然發展為流產，而該部分孕婦使用免疫球蛋白(IVIG)后NK細胞<9%，可使妊娠的成功率上升至82%[6]。

3.3免疫球蛋白對NK細胞升高性復發性流產的治療意義

雖然IVIG實際的治療機制目前尚不明確，調節淋巴細胞活性和細胞因子水平可能是起效原因，但也有研究認為IVIG并無確切的治療價值[15]。Cohen等[5]認為可能的原因是這類研究故意排除了高齡女性，而且IVIG的用量不合理或過量，甚至納入了部分免疫功能異常的女性。本研究以NK細胞作為分組依據，考慮到IVIG的半衰期為23～30d，4周的療程足以達到免疫調節、完成Th1和Th2細胞轉換的目的；同時，有1/3的女性在妊娠期出現NK細胞水平提高，如果沒有在妊娠期停止IVIG可導致25%的女性發生妊娠晚期流產[16]，因此筆者謹慎地采用每月1次的治療方法，有效地避免了NK細胞的再度升高，研究結果表明IVIG對NK細胞升高的RSA女性有確切的治療效果，而NK細胞水平正常組有效率卻較低，可能是因為該部分女性流產的病因與免疫功能關系較弱，而確切的機制需要更多的研究證實。

本研究試驗組IVIG治療有效的原因有幾點：①試驗組均為NK細胞升高的女性；②IVIG治療在受孕前開始進行；③妊娠期間NK細胞上升的女性，繼續給予每月一次的IVIG治療;④由于入選的女性均為IgA水平正常的人群，IVIG過敏反應的風險大大降低[6]，因此合適的人群、適當的治療起始時間是IVIG有效的關鍵。

綜上所述，低劑量IVIG能有效改善NK細胞上升RSA女性的妊娠及正常分娩率，NK細胞應該成為RSA患者的常規檢查。

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