手足口病患兒心肌酶等血清指標的分析

王　喆，張　倩，黎曼儂，黎　麗，李季梅，張　鳳

(1.昆明市婦幼保健院檢驗科；2.兒科，云南 昆明 650031)

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是臨床上發病率較高的傳染性疾病，近年來雖然相關衛生條件有所改善，但HFMD的發病率仍然可達0.6%以上[1]，近3年來呈現出了明顯上升的趨勢，且在部分地區容易呈現暴發流行，嚴重影響了小兒的生命健康。長期的HFMD疾病的進展可導致心肌炎、心內膜炎、肺水腫以及腦膜炎的發生，預后不佳[2-3]。

心臟以及腦部神經組織是HFMD較為常見的累及器官或者組織，對于心腦等重要器官的損傷是增加HFMD患兒后遺癥發生的主要因素。在HFMD發病的早期通過檢測血清學分子標志物或者其他輔助檢查方法，可以為早期糖皮質激素、神經營養性藥物的及時臨床干預提供參考，從而降低遠期神經系統等并發癥的發生，改善預后。α-羥基丁酸脫氫酶(α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase mulscle brain，CK-MB)等是評估心肌細胞損傷的重要標志[4]，而為神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、酸性鈣結合蛋白S100(S-100β)是評估神經系統損傷和受累的重要標志[5]，本次研究重在探討相關血清學指標在不同程度的HFMD患者中的異常表達，進而為早期診斷HFMD患者的心臟以及腦部神經組織的損傷提供重要參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年1月至2016年3月在昆明市婦幼保健院治療的手足口病患兒179例，其中21例為危重型患兒，89例為重型患兒，69例為普通型患兒，同時選取本院門診健康體檢兒童30例(對照組)，納入標準：①手足口病診斷符合衛生部2010年版《手足口病診療指南》[6]；②患兒家屬知情同意并簽署同意書。排除標準：①近3個月有上呼吸道感染或手術史；②合并有神經系統疾病。

1.2標本采集及檢測方法

患者于入院當時采肘靜脈血，2mL血樣在室溫下靜置30分鐘后，4 000r/min離心10分鐘分離血清，并將血清置于4℃搖床上，避免溶血的發生，將血清置于Eppendorf管中，-80℃超低溫冰箱保存，避免反復凍融，為減小批間誤差和測量誤差，全部標本采集完成后一次性成批檢測LDH、α-HBDH、CK和CK-MB水平。放射免疫試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，生化檢測儀器Olmypus 640購自上海精密儀器有限公司。

CTnI的檢測采用化學發光法檢測，采肘靜脈血2mL血樣在室溫下靜置30分鐘后，4 000r/min離心10分鐘分離血清，Beckman counter DXI80 儀器購自上海精密儀器有限公司。

采肘靜脈血2mL血樣在室溫下靜置30分鐘后，4 000r/min離心10分鐘分離血清，4℃保存待測，以標準品稀釋液將標準品復溶，靜置15min后混勻，對比稀釋為7個濃度，取出板條，除了對照孔外每個孔加入不同濃度的標準品，劑量為100μL/孔，采用封板蓋封住，室溫反應120分鐘，使用PBS液體洗滌3次，除了空白對照孔，每孔加入檢測液(100μL)，室溫孵育1小時，PBS洗滌3次，加入底物(50μL/孔)，避光孵育25分鐘，加入終止液5分鐘后測定450nm處吸光度。酶標儀科華KBH ST-300購自上海精密試驗儀器有限公司，NSE、S-100抗體購自南京凱基生物科技有限公司，配套試劑購自羅氏檢測公司，嚴格按照說明書的要求進行操作。

1.3統計學方法

數據處理分析應采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料采用(χ±S)表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較使用LSD檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1患兒基本情況

各組患兒一般臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1各組患兒一般臨床資料比較[χ±S，n(%)]

Table 1 Comparison of general clinical data of children among groups[χ±S，n(%)]

組別例數(n)年齡(y)男/女危重型212．32±0．8113(61．90)/8(38．10)重型892．40±0．7551(57．30)/38(42．70)普通型692．37±0．9442(60．87)/27(39．13)對照組302．41±0．8819(63．33)/11(36．67)F/χ22．1810．458P>0．05>0．05

2.2各組血清心肌酶及心肌肌鈣蛋白Ⅰ比較

手足口病患兒血清LDH、α-HBDH、CK和CK-MB明顯高于對照組，而CTnI明顯低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；危重型手足口病患兒血清LDH、α-HBDH、CK和CK-MB分別為(402.13±34.29)IU/L、(312.37±61.92)IU/L、(154.20±17.82)IU/L和(27.83±9.04)IU/L，均明顯高于重型和普通型患兒，而CTnI為(0.11±0.02)IU/L，明顯低于重型和普通型患兒，差異均具有統計學意義(具P<0.05)，見表2。

表2　　各組血清心肌酶及CTnI比較(χ±S)

注：a與對照組比較P<0.05；b與普通型比較P<0.05；c與重型比較P<0.05。

2.3各組血清神經元特異性烯醇化酶含量比較

危重型和重型手足口病患兒NSE為(27.10±6.52)ng/mL和(19.43±6.10)ng/mL，均高于普通型患兒和對照組，差異均具有統計學意義(均P<0.05)；危重型患兒NSE水平高于重型患兒，差異具有統計學意義(P<0.05)；普通型和對照組NSE比較差異無統計學意義(均P>0.05)，見表3。

表3各組血清NSE含量比較(ng/mL，χ±S)

Table 3Comparison of serum NSE levels among groups (ng/mL，χ±S)

組別例數(n)NSEFP危重型2127．10±6．52abc重型8919．43±6．10ab32．104<0．05普通型6911．20±3．22對照組3010．53±2．81

注：a與對照組比較P<0.05；b與普通型比較P<0.05；c與重型比較P<0.05。

2.4各組血清S-100蛋白水平比較

表4各組血清S-100含量比較(pg/mL，χ±S)

Table 4Comparison of the content of serum S-100β among groups(pg/mL，χ±S)

組別例數(n)S?100bFP危重型21730．14±42．19abc重型89420．11±32．27ab54．291<0．05普通型69314．20±45．58對照組30302．82±56．73

注：a與對照組比較P<0.05；b與普通型比較P<0.05；c與重型比較P<0.05。

3討論

3.1手足口病患兒心肌損傷及神經系統累及的血清標志物研究背景

HFMD主要發生在5歲以下的兒童，潛伏期多為2～10天，平均3～5天，多數HFMD急性起病，發熱、口痛、厭食、口腔黏膜出現散在皰疹或潰瘍，位于舌、頰黏膜及硬額等處為多。嚴重的HFMD患兒在發病1～5天出現腦膜炎、腦炎(以腦干腦炎最為兇險)、腦脊髓炎、肺水腫、循環障礙等，少數病例病情危重，可致患兒死亡。HFMD導致的患兒腦部及心臟的損傷，是HFMD的主要病因。然而迄今為止臨床上對于HFMD發病早期的心臟及腦組織損傷的診斷缺乏有效依據，血清學Cox A16、EV 71等抗原檢測耗時較長，費用較高，多在HFMD發病6～7d以后才逐漸上升[7]，且Cox A16、EV 71等抗原水平檢測并不能提示HFMD腦組織及心肌細胞損傷程度[8-9]。LDH、α-HBDH、CK和CK-MB等是評估心肌細胞損傷的重要標志，在正常人群中由于心肌細胞膜完整而難以進入循環血中，而HFMD由于腸道病毒對于心肌及腦組織的損傷，進而導致細胞膜的破裂，細胞內的LDH、α-HBDH、CK和CK-MB釋放入血，導致外周血中的相關指標顯著上升。但迄今為止對于相關指標的研究僅僅限于心肌梗死患者，而對于HFMD患兒特別是年齡小于3歲的患者，相關心肌損傷指標的生物學標記作用研究不足；NSE主要存在于中樞神經系統組織中，可以通過促進α-磷酸甘油轉化為磷酸烯醇丙酮酸，在神經元細胞損傷后，細胞內的NSE透過血腦屏障進行循環血中，進而導致外周血中的NSE的上升[10-11]；S-100蛋白作為神經元標志性酸性蛋白，主要存在于角質細胞和施萬細胞中，對于中樞神經系統損傷具有重要的標志作用[12-13]，雖然相關研究探討了S-100及NSE在HFMD中的異常表達，但對于S-100和NSE與不同病情嚴重程度的HFMD的關系的探討不足。本次研究的創新性在于首次綜合性分析了5種肌損傷指標在HFMD中的表達，并通過患兒的皮膚黏膜損傷、心腦損傷等進行分級，進而進一步探討S-100和NSE對于早期評估心腦損傷的價值。

3.2心肌酶譜、肌鈣蛋白I等對于手足口病心臟損傷的評估價值

本次研究發現，LDH、α-HBDH、CK和CK-MB在HFMD患者體內明顯高于正常對照組，雖然上升的幅度不一，但多數指標可上升50%以上，其中LDH可上升至402.13±34.29IU/L，而CK-MB可上升至27.83±9.04IU/L，相關心肌細胞損傷指標的上升提示在HFMD發病早期通過檢測血清中LDH、α-HBDH等可以為早期診斷以及臨床干預提供參考。但有趣的是，雖然CTnI也作為心肌損傷指標，但在重型及危重型HFMD患者血清中顯著下降，其中危重型患兒的血清CTnI僅為0.11±0.02IU/L，明顯低于正常對照人群，這與Tan等[8]研究者報道的CTnI平均上升30%～45%數據不符，其主要考慮主要與危重患兒的損傷主要表現為神經系統的受累，雖然心肌細胞存在一定的損傷，但鑒于本次研究中ELISA檢測患兒血清相關指標的時間在發病8h以后，半衰期較短，多數可能已經腎臟的排泄和肝臟的代謝，故表現為CTnI的下降，但仍然需要進一步研究和探討。

3.3神經元特異性烯醇化酶和S-100蛋白在評估手足口病患兒神經系統損傷中的價值

NSE參與腦神經元細胞的磷酸甘油的代謝，并對于神經元損傷具有特異性的標志作用，本次研究中HFMD患兒的血清NSE明顯高于正常對照人群，且病情越重，患兒的血清NSE的表達越高，其中危重型和重型手足口病患兒NSE可達20ng/mL左右，表明NSE可以作為早期診斷HFMD的潛在指標，同時通過動態檢測血清NSE的表達能夠為評估HFMD的腦神經元損傷程度提供參考。Isgro等[14]和陳迪等[15]學者通過分析了43例重型HFMD患兒的血清NSE資料，發現NSE可平均上升45%以上，且NSE大于25ng/mL時，患兒發生腦膜炎及腦干腦炎的幾率可上升5%以上，預后不佳。S-100蛋白是一種反映中樞神經系統損傷的特異性物質，通過對于神經元細胞膜上的磷脂羥基末端的修飾作用，進而參與神經元細胞的相關生理性代謝，S-100蛋白的上升往往提示神經元細胞膜的損傷，本次研究中危重型和重型HFMD患兒血清中的S-100均明顯高于正常對照人群，且危重組患兒的指標上升更為明顯，提示S-100蛋白是評估HFMD患兒腦組織損傷的重要指標，可以在一定程度上反映患兒的腦損傷程度。

3.4總結與展望

綜上所述，血清心肌酶及心肌肌鈣蛋白的檢測能盡早發現手足口病患兒心肌損害，從而有利于早期臨床干預進而改善預后，NSE和S-100蛋白在危重型和重型手足口病患兒中明顯增高，與病情的嚴重程度有關，臨床上通過檢測血清中的NSE或者S-100蛋白水平的表達，能夠為評估腦組織損傷提供參考。但需要注意的是本次研究中的CTnI表達下調與相關研究不符，希望后續研究可以在HFMD患兒發病后的不同時期進行檢測，進而進一步探討CTnI的診斷或者預后隨訪價值。

[參考文獻]

[1]王曉波,杜潘艷,趙麗梅,等.手足口病合并中樞神經系統感染患兒血清中S100B、神經元特異性烯醇化酶水平檢測及意義[J].中國現代醫學雜志,2015,25(30):95-98.

[2]程晰.廣東省2010-2013年手足口病流行病學研究[J].現代儀器與醫療,2015,21(1):106-107.

[3]馮利平,周華斐,童夏生,等.手足口病患兒血清模式識別受體的檢測與易感因素分析[J].中華醫院感染學雜志,2016,26(2):449-451.

[4]馮慧芬,段廣才,朱光.重癥手足口病患兒血清炎性細胞因子動態變化與神經源性肺水腫的關系[J].中華實用兒科臨床雜志,2015,30(6):453-455.

[5]Zhang S Y, Xu M Y, Xu H M,etal.Immunologic characterization of cytokine responses to enterovirus 71 and coxsackievirus A16 infection in children[J].Medicine (Baltimore),2015,94(27):e1137.

[6]羅莉,邢薇佳,廖巧紅,等.兒童腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型感染血清流行病學研究進展[J].中華預防醫學雜志,2015,49(2):184-188.

[7]賈麗,邢明紅,白秀麗.手足口病合并腦炎患兒血清神經烯醇化酶及白介素-18檢測的價值[J].臨床兒科雜志,2012,30(11):1095.

[8]Tan S H, Ong K C, Wong K T. Enterovirus 71 can directly infect the brainstem via cranial nerves and infection can be ameliorated by passive immunization[J]. J Neuropathol Exp Neurol,2014,73(11):999-1008.

[9]高偉.重癥手足口病患兒血清CK-MB、cTnI及PA在病情評估中的臨床意義[J].重慶醫學,2014,42(30):4100-4102.

[10]樂高鐘,吳小秧,文如泉,等.血清S-100B、神經烯醇化酶在重型手足口病患兒顱腦損傷中的檢測意義[J].實用醫學雜志,2014,30(3):412-415.

[11]朱雯,居麗雯,蔣露芳,等.2011年上海地區健康兒童血清腸道病毒71型免疫水平檢測[J].中華傳染病雜志,2013,31(11):650-653.

[12]Matyar S, Goruroglu Ozturk O, Ziyanoglu Karacor E,etal. Biological variation and reference change value data for serum neuron-specific enolase in a Turkish population[J].J Clin Lab Anal,2016,30(6):1081-1085.

[13]Rodriguez-Rodriguez A, Egea-Guerrero J J, Gordillo-Escobar E,etal. S-100β and Neuron-Specific Enolase as mortality predictors in patients with severe traumatic brain injury[J]. Neurol Res,2016,38(2):130-137.

[14]Isgrò M A, Bottoni P, Scatena R. Neuron-specific enolase as a biomarker: biochemical and clinical aspects[J]. Adv Exp Med Biol,2015,867:125-143.

[15]陳迪,李衛華,姜朕.重癥手足口病早期預警指標篩選及其預警價值[J].山東醫藥,2016,56(8):81-82.