p16INK4a和ki67在宮頸CIN Ⅰ～Ⅱ中差異性表達的意義

戈文舜，任麗芳，李美平，魯　波，張　鵬，蔡紅光，楊惠英，包　磊

(浙江省紹興市婦幼保健院病理科，浙江 紹興 312000)

宮頸癌作為發病率第二的婦科惡性腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavir-uses，HPV)持續感染相關，隨著宮頸癌篩查的廣泛開展，很多宮頸癌前病變的早發現早治療，大大降低宮頸癌的發病和死亡率。因此，對宮頸癌前病變的準確診斷及分級對于臨床下一步治療至關重要。2014年，第4版世界衛生組織(World Health Organiza￣tion，WHO)女性生殖系統腫瘤[1]分類用低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesions， LSIL)和高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)替代第3版WHO乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學及遺傳學中宮頸上皮內瘤變的三級分類法(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ)。對于宮頸LSIL，臨床醫師普遍采取定期復查、密切隨訪等處理措施，而HSIL則行宮頸環形電切術(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)進行治療。但在日常工作中，病理診斷會經常碰到鏡下病變介于HSIL與LSIL之間(CINⅠ～Ⅱ)的情況，所以如何明確這種情況下的病變等級就成了首要解決的問題。近年來大量文獻報道， p16INK4a和ki67在HSIL中陽性表達且陽性程度隨病變的加重而升高。因此，本研究通過對CINⅠ～Ⅱ標本進行免疫組化p16INK4a和ki67檢測，分析其表達情況與宮頸病變等級的關系及在病理診斷中的作用與意義。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2012年1月至2015年12月在紹興市婦幼保健院門診行陰道鏡檢查，活檢病理診斷為CINⅠ～Ⅱ同時行免疫組化p16INK4a和ki67檢測，后續治療均行LEEP病例53例。患者年齡為26～56歲，平均39歲。組織學切片由3位高年資病理醫生復閱全部病理切片，至少2位醫師意見一致則確定為最后診斷。診斷標準參照2014年WHO女性生殖系統腫瘤病理學和遺傳學分類標準。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色

標本經10%中性福爾馬林固定，2～3μm厚石蠟切片，常規脫水、石蠟包埋切片。一抗p16(6H12)試劑、ki67(MIB-1)試劑、Envision試劑盒均購自Dako。免疫組化操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.2免疫組織化學陽性標準

p16INK4a：病變層細胞核與/或胞漿連續強陽性表達標記為(++)；基底與/或副基底層細胞不連續或連續弱或至中等強度表達(+)；完全不表達標記為(-)。ki67：陽性信號位于胞核，以陽性細胞百分比數來體現細胞增殖指數。其表達程度借鑒組織學診斷標準(上皮下1/3為界)以30%為界限區分HSIL、LSIL(+，>30%；+，≤30%)。

1.3統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行χ2檢驗和χ2分割法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 CINⅠ～Ⅱ顯微鏡下組織學表現

本組資料中陰道鏡活檢病理診斷CINⅠ～Ⅱ的病例53例，其組織學表現，如下：①鱗狀上皮基底及副基底層細胞輕度-中度異型增生，增殖細胞一般不超過上皮下1/3層，上皮上1/2層或上2/3層往往存在HPV感染表現(挖空細胞)，細胞核大小不等、染色質細顆粒狀、均勻分布、輕度深染、界限清楚，見圖1A、D、G；②少數病例為不典型鱗化和萎縮(鱗化、萎縮基礎上基底及副基底細胞存在異型增生)，細胞層次一般10～15層，細胞異型程度同①,少許細胞核大、深染、核漿比較高,核膜規則。上皮薄、層次少，病變程度較難確定，見圖1D；③個別病例因包埋切面的關系造成上皮腳較深長或者累腺處病變較重(上皮層總體病變為LSIL)，細胞異型程度同①，見圖1。

2.2 CINⅠ～Ⅱ后續LEEP術結果

53例CINⅠ～Ⅱ患者后續LEEP術結果：LSIL 22例(41.51%，22/53)、HSIL 31例(58.49%，31/53，包含1例早期浸潤性鱗狀細胞癌)，見表1。

2.3 p16INK4a及其聯合ki67檢測的統計學意義

53例p16INK4a蛋白檢測者，36例(67.92%，36/53)(++)，見圖1H和17例(32.08%，17/53)(+)，見圖1B、F；p16INK4a(++)聯合ki67檢測者，23例ki67(+，>30%)(63.89%，23/36)見圖1C、I和13例ki67(+，≤30%)(36.11%，13/36)(見圖1F)；兩者陽性表達情況與宮頸病變分級明顯相關，差異有統計學意義(P<0.05)。單純行ki67或聯合p16INK4a(+)者，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4 p16INK4a聯合ki67檢測預測HSIL的價值

p16INK4a(++)聯合ki67(+，>30%)檢測和單純行p16INK4a檢測在CINⅠ～Ⅱ中預測HSIL的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為76.00%(19/25)和80.65%(25/31)、63.64%(7/11)和50.00%(11/22)、82.61%(19/23)和69.44%(25/36)、53.85%(7/13)和64.71%(11/17)。

注：A、D、G為陰道鏡活檢組織學診斷CINⅠ～Ⅱ，其中圖A累腺處病變程度較重 ；圖D上皮層次較少、薄；A、G上皮上1/2或2/3存在明顯的HPV感染；G在LEEP中上皮上1/2存在分化現象 (后續LEEP結果分別為LSIL、LSIL、HSIL伴早期浸潤性鱗狀細胞癌);HE 中倍放大；B、E、H分別為A、D、G的p16INK4a結果(+、+、++)，中倍放大；C、F、I分別為A、D、G的ki67結果(>30%、≤30%、>30%)，中倍放大。

圖1CINⅠ～Ⅱ及其相應p16INK4a和ki67在顯微鏡下的表達

Fig.1Expressions of CIN Ⅰ-Ⅱ and its corresponding p16INK4a and ki67 under microscope

表1p16INK4a聯合ki67檢測與后續LEEP術病理診斷結果對照表[n(%)]

Table 1 Comparison of results of p16INK4acombined with ki67 detection and follow-up LEEP pathological diagnosis[n(%)]

檢測項目　LEEP術病理診斷結果　HSIL(n=31)LSIL(n=22)χ2Pp16INK4a5．5470．019　(++)25(47．18)11(20．75)　(+)6(11．32)11(20．75)ki673．5010．061　(+，≤30%)9(16．99)12(22．64)　(+，>30%)22(41．51)10(18．86)p16INK4a(++)5．2020．023　ki67(+，≤30%)6(16．67)7(19．44)　ki67(+，>30%)19(52．78)4(11．11)p16INK4a(+)0．0320．858　ki67(+，≤30%)3(17．65)5(29．41)　ki67(+，>30%)3(17．65)6(35．29)

3討論

3.1 p16INK4a與ki67在CINI～Ⅱ中差異性表達的機制及統計學意義

p16INK4a是細胞周期蛋白依賴性激酶CDK的抑制因子，負調控細胞周期，特別是在高危型HPV感染的HSIL和子宮頸癌組織中常常可檢測到強陽性表達，原因是HPV E6、E7蛋白在子宮頸細胞內表達，競爭性抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)與視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)的結合，使Rb失活，激活轉錄因子E2F，造成p16INK4a蛋白過表達[2]。ki67是一種細胞增殖活性相關抗體，其陽性比例反映出細胞增殖指數。大量研究顯示，p16INK4a及Ki67的陽性程度隨CIN級別提升而增加，可以很好地輔助病理診斷[2-6]。但在宮頸病變細胞中p16INK4a陽性判讀標準，查閱大量文獻，各有不同。本實驗通過觀察p16INK4a蛋白和ki67在CINⅠ～Ⅱ中表達的差異性，對比后續LEEP結果(LSIL 、HSIL)尋找其陽性規律。結果發現，p16INK4a(++)和(+)，兩者在病變分級中存在差異性，有統計學意義(P<0.05)。有關ki67的表達程度借鑒組織學診斷標準(上皮下1/3為界)以30%為界限區分HSIL與LSIL，雖然在CINⅠ～Ⅱ的基礎病變中ki67增殖指數主要集中在30%左右,但是其中LEEP結果為LSIL(特別是濕疣)的病例ki67(+，>30%)所占的比重不低(45.45%，10/22)，差異無統計學意義(P>0.05)。但是在p16INK4a(++)的基礎上結合ki67檢測，ki67(+，>30%)與(≤30%)之間差異有統計學意義(P<0.05)，而且p16INK4a(++)結合ki67(+，>30%)對比單純p16INK4a(++)，就預測HSIL而言，敏感性及陰性預測值相差不大，特異性和陽性預測值卻有顯著提高。

3.2 p16INK4a結合ki67在CINⅠ～Ⅱ中差異性表達的診斷意義及預測價值

CINⅠ～Ⅱ患者，本身存在基底及副基底層細胞異型增生的基礎病變，這部分病變層細胞如果表達p16INK4a(++)及ki67(+,>30%)，那么其后續為HSIL的可能性大大增加，這也符合p16INK4a及ki67的陽性率隨病變級別提升而增加的特點。然而，有學者認為超過30歲的LSIL患者進展的風險更高，其預后與p16INK4a過表達無關，而是年齡[7]；也有學者認為p16INK4a在CINⅠ患者中陽性表達存在一定預測價值，應進行重點隨訪[8]。

p16INK4a在LSIL中確實存在陽性表達，在CINⅠ～Ⅱ中,特別是p16INK4a(+)，類似乳腺癌CerbB-2在癌組織中表達1+或2+的陽性狀態，其表達意義和預后情況是否與p16INK4a(-)一致，今后需要進一步大樣本分析。現階段本實驗結論：p16INK4a可以作為早期宮頸病變預后的預測因子，在CINⅠ～Ⅱ患者中，若p16INK4a(++)及ki67(+,>30%)則可作為HSIL的輔助診斷。

總之，對不典型鱗化、萎縮及包埋切片造成假象的或者診斷意見不統一等有疑問的CINⅠ～Ⅱ活檢標本可以進行p16INK4a及ki67染色，以提高病理診斷的準確性和可重復性。p16INK4a蛋白病變層細胞核與/或胞漿連續強陽性表達是LSIL發展為HSIL的重要信號，聯合ki67(>30%)檢測可用于分流CINⅠ～Ⅱ，對這類患者臨床應根據其實際情況選擇密切隨訪或及時治療。

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