植入前遺傳學篩查中不同形態特征的胚胎整倍體率比較

施文浩，張四林，王永博，師娟子

(西北婦女兒童醫院生殖中心，陜西 西安 710003)

在自然生殖發育過程中，細胞分裂時期染色體不分離、減數分裂時期染色單體提早分離和染色體丟失引起胚胎染色體異常包括數量和結構異常，數量異常更為常見，主要表現為非整倍體。隨著胚胎體外培養研究的深入，發現人類胚胎染色體非整倍體改變在體外受精一胚胎移植中十分常見[1]，是導致胚胎發育異常、著床失敗、自發流產、死產等妊娠失敗的主要原因[2]。植入前遺傳學篩查或診斷(preimplantation genetic screening/diagnosis，PGS/PGD)，在胚胎植入著床之前，對早期胚胎進行染色體數目和結構異常的檢測，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低流產率預防出生缺陷。但是PGS的主要缺點是有創，對胚胎后續發育有一定損傷[3]，且遠期損害仍不明確[4]。其次檢測費用居高不下，對于植入前遺傳學篩查的廣泛應用造成困難。已有研究發現染色體的整倍體性與胚胎形態學參數存在一定關系[5-6]，因此有必要對預測整倍體的胚胎參數進行研究，在無法進行PGS時提供更有效的預測整倍體胚胎預測方法。本文從西北婦女兒童醫院生殖中心PGS活檢胚胎染色體結果分析，比較不同發育形態參數胚胎的整倍體和非整倍體率，研究胚胎發育形態學參數與整倍體的相關性。

1資料與方法

1.1研究對象與分組

收集2015年1月1日至2017年4月30日西北婦女兒童醫院生殖中心行PGS的常規體外受精-胚胎移植患者，以其所檢測胚胎為研究對象。PGS檢測在西北婦女兒童醫院醫學遺傳中心完成，采用微陣列比較基因組學技術(BlueGnome 24SureV3)檢測。所有進入臨床PGS周期的患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 體外受精胚胎培養及活檢

采用常規的促排卵方案，當優勢卵泡中有1個直徑達到18mm(或者有1/3個卵泡達到18mm)時注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)10 000IU，36～38h后經陰道超聲下取卵。取卵后4～6h常規卵胞漿內單精子注射，然后采用序貫培養(vitrolife G-series)胚胎至第3天或第6天，活檢時間為受精后第3～6天，卵裂期胚胎在第3天進行卵裂球活檢，活檢1枚卵裂球送檢；囊胚在受精后第5天或第6天活檢，活檢部分外胚層細胞(5～10個)送檢?；顧z后卵裂期胚胎或囊胚冷凍保存。

1.2.2 卵裂期胚胎和囊胚的評分參數

卵裂期評價為多個參數的綜合評價，主要參數為D3天胚胎卵裂球數目、碎片體積比例和不均卵裂球數目。囊胚評價采用Garnder囊胚分級法。先根據囊胚的擴張和孵出程度將囊胚分成1～6期，其中3期為完全擴張囊胚，囊胚腔占據整個囊胚；4期為擴張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴大，透明帶變薄；5期為正在孵化的囊胚，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；6期為孵化出的囊胚,囊胚完全從透明帶中脫出。內細胞團和外胚層細胞評分根據細胞數目和緊湊程度評價，A級為細胞數目多，結合緊密；B級為細胞數目較少，結合較松散；C級為細胞數目極少。

1.2.3 PGS檢測

活檢細胞采用單細胞基因組擴增，采用SurePlex DNA Amplification System 試劑盒進行全基因組擴增，然后通過array-CGH方法(Blue Gnome 24SureV3 package kit)對擴增后的產物進行檢測，BlueFuse Multi軟件分析并出具PGS報告。

1.3統計學方法

全部數據采用SPSS 6.0統計軟件進行統計學處理，率的統計學檢驗采用χ2檢驗，等級資料率的檢驗采用秩和檢驗，計量資料采用t檢驗或非參檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1基本數據

PGS共活檢348枚胚胎，成功檢測322枚胚胎，其中整倍體胚胎數目為123(38.20%)，非整倍體胚胎數目為199(61.80%)，整倍體與非整倍體胚胎的基本數據詳見表1。其中PGS指征和男方正常精子形態率的整倍體與非整倍體率比較有統計學差異(P<0.05)，見表1。

表1整倍體與非整倍體胚胎的基本數據[χ±S,n(%)]

Table 1Basic data of aneuploid and aneuploid embryos[χ±S,n(%)]

項目整倍體(n=123)非整倍體(n=199)t/χ2P母親年齡(歲)31．37±3．8032．23±5．09-0．930．35男方年齡(歲)33．20±4．6634．21±6．03-1．040．30不孕癥類型0．640．43　原發32(26．02)60(30．15)　繼發91(73．98)139(69．85)女方基礎促卵泡素6．33±2．456．74±2．43-1．430．16PGS指征7．890．02　復發性流產及　反復種植失敗62(50．41)105(52．76)　不良孕產史24(19．51)18(9．05)　其他37(30．08)76(38．19)　基礎竇卵泡數(個)13．80±5．8812．68±5．531．720．09　正常形態精子率(%)0．03±0．030．02±0．023．210．01

注：嵌合體按非整倍體計算。

2.2卵裂期胚胎參數與胚胎整倍體

卵裂期胚胎評價參數采用D3天胚胎卵裂球數目、碎片體積比例和不均卵裂球數目，比較整倍體與非整倍體間胚胎參數的差異。碎片體積比例在整倍體與非整倍體組中具有統計學差異(P<0.05)，D3天胚胎卵裂球數目和不均卵裂球數目未檢驗出統計學差異(均P>0.05)，見表2。

表2卵裂期胚胎整倍體與非整倍體的胚胎參數比較(χ±S)

Table 2Comparison of embryo parameters between euploid and aneuploid in cleavage phase (χ±S)

項目整倍體(n=9)非整倍體(n=52)t/ZPD3卵裂球數目8．00±0．877．56±1．36-1．130．26碎片體積比例0．03±0．040．08±0．06-2．600．01不均卵裂球數目0．56±0．530．41±0．540．740．46

注：D3表示活檢時間為受精后第3天。

2.3囊胚參數與胚胎整倍體

囊胚評價參數采用活檢時間(D4～D5，D6)、囊胚擴張期別(3期，4期，5～6期)、內細胞團形態(A/B，C)、外胚層形態(A/B，C)，比較不同囊胚參數之間整倍體與非整倍體發生率的差異?；顧z時囊胚擴張期別在整倍體與非整倍體發生率具有統計學差異(P<0.05), 活檢時間(D4～D5，D6)、內細胞團形態(A/B，C)和外胚層形態(A/B，C)未檢驗出統計學差異(均P>0.05)，見表3。

表3囊胚參數的整倍體與非整倍體發生率比較[n(%)]

Table 3 Comparison of the incidence of euploidy and aneuploidy in parameters of blastocyst[n(%)]

項目整倍體(n=114)非整倍體(n=147)χ2P活檢時間　D4～D590(78．95)116(78．91)00．99　D624(21．05)31(21．09)活檢時的囊胚評分　擴張期別　　3期8(7．02)19(12．93)2．000．01　　4期92(80．70)123(83．67)　　5～6期14(12．28)5(3．40)內細胞團形態　A/B65(57．02)84(57．14)00．98　C49(42．98)63(42．86)外胚層形態　A/B21(18．42)37(25．17)1．690．19　C93(81．58)110(74．83)

注：D4～6表示活檢時間為受精后第4～6天；囊胚評分采用Garden評分標準。

3討論

3.1胚胎發育形態參數與非整倍體的相關性

胚胎染色體的非整倍體與胚胎發育密切相關，2011年Alfarawati研究顯示卵裂期胚胎中染色體非整倍體現象普遍存在，而形態評分較差的胚胎，其染色體非整倍體率高于形態較好胚胎。囊胚期胚胎形態也與染色非體整倍體可能相關，2011年關小紅研究提示形態學評分較差的廢棄胚胎繼續培養，其中大部分囊胚發育延緩且形態較差, 活檢PGS后染色體異常發生率相對較高。仍有研究提示囊胚內細胞團形態評分對整倍體囊胚移植后的持續臨床妊娠率有較高的預測價值[7]。因此胚胎染色體非整倍體體與胚胎形態可能存在一定的相關性。

3.2卵裂期胚胎碎片和活檢時囊胚擴張形態與非整倍體

本研究結果顯示卵裂期胚胎評價參數中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高，檢驗出統計學差異(P<0.05)，D 3天胚胎卵裂球數目和不均卵裂球數目未檢驗出統計學差異(P>0.05)。囊胚形態參數中活檢時的囊胚擴張期別越高，整倍體率越高。由此推測，早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚發育較快的胚胎整倍體率可能較高。

已有研究提示，卵裂期胚胎碎片比例較高的胚胎，檢測后發現染色體異常風險較高，如有研究報道碎片比例>35%的卵裂期胚胎形成的囊胚中，染色體異常率為70%～90%[8]。2001年Ebner發現碎片較高的胚胎移植后妊娠結局較差，胎兒畸形率較高，由此說明胚胎的非整倍體和胚胎碎片比例有一定的相關性，碎片比例較高的胚胎染色體非整倍體風險較高。胚胎染色體異常與胚胎發育關系密切，有研究指出染色體異?？蓪е虏煌A段胚胎發育停滯，延長培養時間后染色體異常的胚胎可能出現發育停滯等，整倍體胚胎可能繼續發育，因此囊胚階段發育較快的囊胚的整倍體概率可能更高[9-10]。

通過我院PGS患者的染色體結果分析得出，卵裂期胚胎評價參數中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高,囊胚形態參數中活檢時的囊胚擴張期別越高，整倍體率較高。因此早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚發育較快的胚胎整倍體率較高。

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