芽孢染色實驗中枯草桿菌最佳培養條件探索

樊 佳, 韓 煦, 陶榆瑋, 徐 璕, 楊富強, 汪 紅, 鄭冬超

(四川大學 生命科學學院 生物科學實驗教學中心, 四川 成都 610065)

芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細菌生長到一定階段形成的一種抗逆性很強的休眠體結構,也叫內生孢子,通常為圓形或橢圓形。能否產生芽孢、芽孢的形狀、芽孢在芽孢囊中的位置、芽孢囊是否膨大等特征是細菌分類的重要指標[1]。細菌的芽孢染色是微生物教學中的經典實驗,本科實驗中常選取枯草芽孢桿菌作為實驗材料,通過孔雀綠初染以及番紅復染,觀察芽孢形成各個階段的形態特征,從而使學生更充分地了解芽孢的形成過程[1-4]。

芽孢染色實驗需要選取適當菌齡的菌株作為實驗材料,芽孢成熟度、芽孢與營養體細胞的比例等都會影響實驗效果,待觀察菌株的培養條件對實驗效果有著重要影響。在目前本科教學中普遍使用的多個版本的微生物實驗教材中,均沒有針對適宜枯草桿菌芽孢觀察的具體培養條件給出明確說明[4-6],實驗教師只能依據經驗準備菌種材料,導致實驗結果的隨機性太大,學生在實驗過程中不易找到芽孢,或無法同時觀察到不同生成階段的芽孢。目前文獻報道提高芽孢產率[5-9]以及芽孢形成機理[10]的研究比較多,很少有觀察枯草桿菌芽孢形成過程的最佳培養條件的研究。

本實驗在控制接種菌的初始狀態及菌液濃度前提下,通過改變培養溫度和時間2個最易操作的變量,以芽孢成熟度為標準,尋找最適于觀察的培養條件,使學生能更容易地觀察到芽孢形成各個階段的形態特征和芽孢的形成過程,提高學生做實驗的成功率。

1 材料與儀器設備

1.1 材料

材料菌種：枯草芽孢桿菌為四川大學微生物實驗室保存菌種。

培養基：牛肉膏蛋白胨液體及固體培養基。

染色劑：5%孔雀綠水溶液，番紅染液。

1.2 儀器設備

恒溫箱，水浴鍋，酒精燈，培養皿(直徑9 cm)，載玻片，接種環，Olympus顯微影像分析系統(1130萬像素數碼CCD、最高分辨率1280像素×1024像素)

2 實驗方法

2.1 菌種活化

冷凍保藏的菌種經斜面接種活化后,接入液體培養基,測定其在600 nm的吸光度值。取少量培養前菌種制片并染色鏡檢其生長狀態。調整細菌濃度和培養狀態至適宜程度后接種培養。為了控制接種菌的初始狀態,實驗統一接種菌懸液濃度使吸光度A600 nm=0.44,冷凍菌種活化48 h。

2.2 菌種培養

取200 μL調整好的菌種懸液涂布于平板上倒置培養；將培養皿平均放入25、30、35、40 ℃的培養箱中,于24、30、36、42、48、54 h后取菌種制片觀察；隨后再將同一生長狀態的菌懸液涂布平板,放置在37 ℃箱中,于24、30、36、42、48、54 h后取菌種制片觀察。以上所有實驗步驟均進行了多次平行重復實驗。

2.3 制片及染色

干燥固定后用浸染法進行芽孢染色:將載玻片放入加熱的孔雀綠染液(50 ℃水浴)中浸染20～25 min,取出后緩水流沖去多余染液；再用番紅復染1.5 min,沖去多余染液后烘干；用油鏡觀察并攝像。鏡檢結果通過顯微攝像,客觀評價枯草桿菌芽孢生長狀態[5-7]。

2.4 鏡檢評價標準

以芽孢成熟度作為鏡檢評價標準，具體分級如下:

0級:所有營養體細胞均沒有芽孢產生；

I級:有極少量芽孢形成初期的營養體細胞；

II級:有數量較多芽孢形成初期的營養體細胞,沒有游離芽孢出現；

III級:既有芽孢形成初期的營養體細胞,又有游離的芽孢,二者比例約為1∶1；

IV級:大部分為游離的芽孢,有少量芽孢形成初期的營養體細胞;

V級:全部為游離芽孢或基本全為游離芽孢。

3 結果與分析

圖1為培養前初始菌株的芽孢染色圖,可以觀察到初始營養體細胞形態細長,未產生芽孢。

圖1 培養前初始菌株芽孢染色

不同溫度和時間條件下的枯草桿菌芽孢生長狀態見圖2。從圖2可以觀察到:在同一溫度下,隨著時間的推移,營養體細胞形態由細長狀變為粗短狀,芽孢數量逐漸增多；而在同一時間內,隨著溫度的升高,芽孢形成數量也呈上升趨勢。在25 ℃下芽孢形成數量最少,24～36 h沒有芽孢形成,42～54 h有極少量芽孢形成初期的營養體細胞。30 ℃培養時,24 h沒有芽孢形成,30～48 h有極少量芽孢形成初期的營養體細胞,56 h芽孢數量較多,但沒有成熟脫落的芽孢出現。35 ℃培養時,24 h沒有芽孢形成,30 h有少量芽孢形成,42～48 h芽孢與營養體細胞比例適中,既有芽孢形成初期的營養體細胞,也有成熟的芽孢,兩者比例約為1∶1；54 h大多為游離芽孢。40 ℃培養時,24 h即產生了芽孢,30～36 h既有營養體細胞也有游離芽孢,42～54 h時多為成熟脫落的芽孢。雖然40 ℃培養36 h也能觀察到不同形成階段的芽孢,但此溫度的實驗結果存在2個重大缺陷:一是40 ℃下芽孢生長進度過快,易錯過最佳觀察期；二是高溫易導致菌體死亡,使得初染的染色效果不佳,大量應被孔雀石綠染為藍綠色的芽孢呈現出淡綠色或白色,部分甚至被復染的番紅染液染成紅紫色,最終觀察到的芽孢顏色駁雜,因此不建議把40 ℃列為適宜培養溫度。從圖2可以初步得到如下結論:在25～30 ℃的溫度范圍內,枯草桿菌培養24～54 h尚不能形成成熟脫落的芽孢；在35～40 ℃的溫度范圍內,枯草桿菌可以進行完整的發育過程,但在40 ℃下因溫度過高使得觀察效果不佳,故應選取稍低的溫度作為培養條件。在實驗設立的條件中,35 ℃培養42～48 h最適宜進行芽孢的結構特征觀察實驗。

圖2 不同溫度和時間條件下的枯草桿菌芽孢生長狀態

基于以上實驗結果,并有參考文獻[9]指出37 ℃下枯草芽孢桿菌的產芽孢率較高,又在原有的實驗基礎上增設了37 ℃這一溫度條件,對37 ℃下培養24～54 h枯草桿菌芽孢的生長狀態進行了檢測。實驗結果如圖3所示:在37 ℃下,培養24 h即有零星芽孢產生；30 h只有形成初期的營養體細胞；36～42 h既有芽孢形成初期的營養體細胞,也有游離芽孢；48 h大部分為游離芽孢,有少量芽孢形成初期的營養體細胞,54 h只有游離芽孢。因此得出37 ℃培養36～42 h是進行芽孢染色觀察實驗的適宜培養條件。

圖3 37 ℃培養24～54 h枯草桿菌芽孢的生長狀態

以芽孢成熟度為評價標準,對不同培養溫度和時間組合下的芽孢觀察效果進行了評價，結果見表1?？芍?5 ℃條件下,24～36 h芽孢成熟度為0級,沒有芽孢產生。42～54h芽孢成熟度為I級,芽孢數目偏少,觀察效果不佳,不建議選取25 ℃作為培養溫度；30 ℃條件下,30～48 h芽孢成熟度為I級,54 h芽孢成熟度為II級；35 ℃條件下,42～48 h芽孢成熟度達到III級,此時產生大量的芽孢,既有芽孢形成初期的營養體細胞,又有成熟脫落的芽孢,兩者比例約為1∶1,有利于學生觀察芽孢形成各個階段的形態特征,從而更加充分地了解芽孢形成過程,54 h時芽孢成熟度為IV級。37 ℃條件下,36～42 h芽孢成熟度達到III級,48 h時芽孢成熟度為IV級,54 h時芽孢成熟度為V級；40 ℃條件下,42 h時芽孢成熟度達到IV級,48～54 h芽孢成熟度為V級。在實驗教學過程中,芽孢數量過少、只有游離芽孢沒有芽孢形成初期的營養體細胞,都不利于學生觀察芽孢的形成過程。為了讓學生更好地觀察到各個時期的芽孢形態,建議選取芽孢成熟度為III級,即35 ℃下培養42～48 h,以及37 ℃下培養36～42 h作為最佳培養條件[11-12]。

表1 不同培養溫度和時間組合下的芽孢成熟度評價

4 討論

芽孢染色實驗需要選取適當菌齡的菌株作為實驗材料,幼齡菌尚未形成芽孢,而老菌齡芽孢囊已經破裂,這些都會影響實驗觀察效果。本實驗利用實驗室條件,嚴格控制接種菌的初始狀態及濃度,改變溫度和時間對產芽孢影響最顯著的變量[6],全程監測記錄芽孢形成過程。實驗趨勢顯示:在同一溫度條件下,隨著時間的增長,芽孢成熟度逐漸增加；在同一時間內,隨著溫度的增加,芽孢成熟度逐漸增加,溫度與時間與芽孢成熟度呈正相關。實驗結果表明:選擇芽孢含量較少的初始菌,在35 ℃下培養42～48 h或在37 ℃下培養36～42 h可獲得最佳視野,裝片中芽孢和營養體細胞數量適宜,易清晰觀察到芽孢形成各個時期的狀態,適于作為觀察材料。該結果為芽孢染色實驗中菌株的培養時間和溫度提供了參考,提高了實驗的效率和成功率,方便了教學材料的準備,適于在普通本科微生物實驗教學中推廣應用。

References)

[1] 孫桐,李忠.國外對芽孢桿菌屬芽孢長久存活機制的研究進展[J].微生物學免疫學進展,1996,24(2):78-80.

[2] 惠明,竇麗娜,田青,等.枯草芽孢桿菌的應用研究進展[J].安徽農業科學,2008,36(27):11623-11624,11627.

[3] 李明,雙寶,李海濤,等.枯草芽孢桿菌的研究與應用[J].東北農業大學報,2009,40(9):111-114.

[4] 沈萍，陳向東.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,2007.

[5] 唐麗杰.微生物學實驗[M].哈爾濱:哈爾濱工業大學出版社,2005.

[6] 胡開輝. 微生物學實驗[M].北京:中國林業大學出版社,2004.

[7] 鄭冬超,樊佳,王雨昊,等.浸染法改良細菌芽胞染色實驗的探索[J].實驗技術與管理,2015,32(7):191-192，209.

[8] 郭夏麗,狄源寧,王巖.枯草芽孢桿菌產芽孢條件的優化[J].中國土壤與肥料,2012(3):99-103.

[9] 胡小加,謝立華,余常兵,等.枯草芽孢桿菌Tu-100的芽孢形成與發酵條件優化的研究[C]//第四屆全國微生物資源學術暨國家微生物資源平臺運行服務研討會論文集.2012:112.

[10] 劉寬博,謝遠紅,熊利霞,等.一株產抗單增李斯特菌細菌素的枯草芽孢桿菌C3 產芽孢條件的優化[J].飼料研究,2016(7):45-53.

[11] 翟蓓蓓,閆志宇,李術娜,等.乙草胺降解菌株枯草芽孢桿菌L3 產芽孢條件的優化[J]. 河南農業科學,2016, 45(10):98-102.

[12] Douglas Higgins, Jonathan Dworkin. Recent progress in Bacillus subtilis sporulation[J].FEMS Microbiol Rev, 2012,36(1): 131-148.