隴南花椒葉片內生菌分離及物種多樣性研究*

魯 坤, 曹永紅

(1.隴南市林業局，甘肅 隴南 746000；2.隴南市經濟林研究院花椒研究所，甘肅 隴南 746000)

花椒是指蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和青椒(Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.)的干燥成熟果皮[1]。花椒在我國的使用有著悠久的歷史，作為一味傳統中藥材，具有溫中散寒、除濕和殺蟲止痛等作用；作為一種食用香辛料，被譽為“八大味”之一，也是川菜的主要調味品之一[2]。現代研究發現花椒最重要的用途是香辛料，用于食品的烹調加工調味，有賦香、著色、防腐、掩蓋異味及增加食欲等作用[3]。

隴南地處亞熱帶向暖溫帶過渡氣候區,境內高山、河谷、丘陵、川壩、盆地錯落相間，海拔在550―4200m之間，年平均氣溫15℃，氣候濕潤、無霜期長、光熱資源豐富。優越的氣候特點，為花椒的發展提供了得天獨厚的條件，所產隴南“大紅袍”花椒以果皮丹紅、粒大飽滿、芳香濃郁、麻味醇厚而久負盛名[4]。

內生菌長期生活在植物體內特殊環境中并與之協同進化，在演化過程中形成了互惠關系，一方面，植物為內生菌提供其光合作用產物和礦物質以滿足其生長必需的能量和營養需要；另一方面，內生菌通過自身代謝產物或借助于信號傳導作用對宿主產生影響。甚至發現[5]內生菌不僅能參與植物次生代謝產物的合成、促進其生成、積累及對其的轉化，還能獨立產生與宿主相同或相類似的生物活性物質，是天然產物的重要來源。1993年美國蒙大拿州立大學Stierle[6]等首次報道從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的韌皮部分離到一株能產生抗癌物質紫杉醇的內生真菌(Taxomycesandreanae)，掀起了在植物內生菌中尋找新物質的熱潮，國內外相關研究報道很多[7―13]。但是，目前國內外對花椒的研究主要著眼于其生物性狀與組織鑒別、化學成分分析[14]、藥理研究[15]、相關產品加工應用[16]等方面，但對于花椒內生菌的研究較少，未見有關花椒枝葉片內生細菌物種多樣性的報道。本研究通過對隴南花椒種植區樣品的采集，對存在于花椒葉片中的內生細菌進行了分離和鑒定，旨在為花椒內生細菌(Endophytic bacteria)的綜合開發利用提供參考，特別是在為利用花椒內生菌研制生物源農藥方面提供直接依據。

1.材料和方法

1.1樣品采集

從甘肅隴南各花椒種植區，參考平行線取樣法[17]，采集健康和感病的4―8年樹齡的花椒樹枝葉片20份，共計360份，裝入封口袋中，帶回實驗室放入4度冰箱備用。

1.2培養基

NA培養基：牛肉浸膏3.0g，蛋白脈10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000ml，pH值7.0。

1.3內生菌的分離

采用預實驗中摸索的條件對樣品進行表面消毒，即將采集的花椒葉片分別稱重。將樣品用自來水沖洗20分鐘，用濾紙片吸取表面的水分；放入2%的次氯酸鈉中表面消毒2分鐘，用滅菌的濾紙片吸干表面的液體；再放入75%的酒精中滅菌3分鐘，經過表面消毒的樣品用無菌水漂洗3次，每次2分鐘，再用無菌濾紙片吸干表面水分后用于內生菌的分離。驗證樣品表面消毒是否徹底，取第三次漂洗的水樣200μl分別涂布于NA培養基平板中，用封口膜將平板封口后于32℃培養箱中培養3天，如果平板上沒有長出菌落，證明消毒徹底。

在超凈工作臺內，將消毒徹底的樣品放入無菌研缽中，加入10ml無菌水進行研磨，用無菌的兩層擦鏡紙進行過濾去除組織殘渣，取1ml濾液用無菌水梯度稀釋到10-3，取該稀釋度的樣品200μl，涂布到NA培養基平板上，每個樣品3個重復，用封口膜將平板封口后放入32℃培養箱中培養3―5天，統計菌落數，再根據菌落大小、形態和顏色挑取和純化內生細菌，對每一組樣品，從培養基平板上純化20株內生細菌。

1.4內生生防菌的系統發育分析

用細菌DNA提取試劑盒(BioTeke Co-poration，China，Cat#DP2001)按說明書提取細菌基因組DNA。以試劑盒提取的細菌基因組DNA為模板，采用通用引物27F(5'―AGAGTTTGATCCTGGCTCAG―3')和1492R (5'―GGTTACCTTGTTACGACTT―3')擴增 16S rRNA 基因。PCR反應體系(50μL):10×PCR buffer(2.5 mmol/L)5.0μL，10 mmol/L dNTPs(2.5 mmol/L)4.0μL，27F(10μmol/L)2.0μL，1492R(10μmol/L)2.0μL，TaqDNA聚合酶(5UμL―1)0.5μL，DNA 2.0μL，ddH20，34.5μL。PCR反應程序：95℃預變性10min，95℃變性1min，50℃退火1 min，72℃延伸2min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增產物送北京華大基因科技股份有限公司測序。獲得的DNA序列提交到GenBank核酸數據庫。將測序獲得的序列分別與GenBank上的序列進行BLAST相似性比較并下載與目標序列同源性最高的同源序列。將目標序列及其同源序列合并保存為單一的Fasta文件，多序列的比對排列依靠軟件ClustalX[18]，并進行手工校對，再用Bioedit軟件對比對結果進行手工調整以提高比對質量。分別采用MEGA(版本:6.06)軟件包中的Kimura two―parameter矩陣模型和Neighbor―joining法進行親緣距離的計算和系統發育樹的構建，對Gap的處理采用Pair-wise Deletion。采用重抽樣法(Bootstrapping)對分枝節點的置信度進行評價，Bootstrap抽樣重復次數為1000次。

2.結果

2.1花椒葉片內生細菌生物量

本次實驗中分離的到的花椒葉片內生細菌的數量為2.8×105CFU/g。

2.2花椒內生細菌的物種多樣性

基于16S rRNA基因序列的系統發育分析表明，50株花椒內生細菌歸屬于厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)(表1,圖1)。在分析的內生細菌中，屬于壁厚菌門(Firmicutes)的種類在數量上占優勢，共有42株株，占總數的84%。變形菌門有7株占總數的14%，放線菌門有1株，占總數的2%。

在厚壁菌門的42株菌株，屬于6個屬，19個種，其中芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)在數量上占優，共有36株，占該類群的85.70%。在芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)中共有13個種，B.timonensis和B.siamensis為優勢種，分別有11株(占芽孢桿菌屬菌株總數的30.56%)和8株(22.22%)，這些菌株與其近緣種的同源相似性分別為98.2―99.2%和99.79―99.93%，余下的17個菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)的11個種(相似性98.05%―99.86%)，B.aryabhattai(3株)，B.altitudinis(3株)，B.safensis(2株)和B.velezensis(2株)，B.zhangzhouensis(1株)、B.subterraneus(1株)、B.oryzisoli(1株)、B.oceanisediminis(1株)、B.mesonae(1株)、B.depressus(1株)，B.atrophaeus(1株)；厚壁菌門(Firmicutes)的另外6個菌株中，1株屬于Brevibacilluspanacihumi，1株屬于B.formosus，1株屬于Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum1株屬于Paenibacilluslautus1株屬于Lysinibacillusmacroides1株屬于Terribacillusaidingensis，相似性均大于98.56%。

共有6株內生菌屬于變形菌門(Proteobacteria)，占總菌株的12%這些菌株分屬于5個屬5個種，2株屬于Paracoccussanguinis(相似性99.92%)，1株屬于Serratiamarcescenssubsp.marcescens(相似性99.93%)，1株屬于Brevundimonasvesicularis(相似性99.70%)，1株屬于Alcaligenesfaecalissubsp.faecalis(相似性99.93%)；1株屬于Achromobacterspanius(相似性99.86%)。

共有1株內生菌屬于放線菌門(Actinobacteria)，占總菌株的2%，屬于Micrococcusendophyticus(相似性99.93%)。

3.討論

植物內生菌在植物中無所不在，幾乎在所有研究過的組織中均有分布[19]。植物內生菌有利于宿主植物，其中的一些種類也有利于人類，比如內生菌的細胞或代謝產物在在醫藥、農業及工業上的應用[20]。相對而言，內生菌比植物附生菌和土壤微生物在植物體內的生態位競爭上更占優勢[21―23]，因此，內生菌常被認為是研發生物肥料和生防制劑的良好資源[19,22,24―26]。目前，很多植物種類的內生菌已被報道，但花椒樹枝葉片內生細菌物種多樣性的研究很少。本研究從花椒樹枝葉片中分離得到5000株內生細菌，通過顏色、形態、生長量等指標，篩選出50株內生細菌，并對其種類多樣性進行了分析。通過文獻檢索，本研究花椒內生細菌的多樣性分析屬首次報道。

本研究從花椒樹枝葉片中分離內生細菌，以期得到花椒內生細菌的分布特征。Firmicute門的菌株出現頻率最高，尤其是Bacillus屬的菌株。芽孢桿菌(Bacillusspp.)在土壤、植物體內和水等生態環境作為優勢種已被廣泛報道[27―30]。

花椒作為甘肅隴南的主要經濟林作物和當地農民的主要經濟收入來源的特色產業。目前為止，未見針對花椒內生細菌物種多樣性的研究報道，本研究分離得到花椒內生細菌26個種，為花椒內生菌物種多樣性提供了科學的數據，也為開發利用內生菌防治花椒病害打下了堅實基礎。