miR?345抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖能力研究*

楊 琴，王 杰，呂沐瀚，唐世孝△（.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州646000；.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院肝膽胰外科，四川64000）

胰腺癌是消化道最具惡性的腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，在腫瘤相關(guān)致死性疾病中，胰腺癌已位居第4位[1]。近年來，胰腺癌的治療方式不斷得到發(fā)展，但是胰腺癌患者仍然保持極低的生存率，其5年生存率僅為8%[1-2]。目前，治療胰腺癌的主要手段是行手術(shù)治療，然而患者被診斷為胰腺癌時往往錯過了最佳手術(shù)時機，預(yù)后極差[3]。導(dǎo)致這一不良結(jié)局的主要原因之一是胰腺的解剖位置較深。一方面，常規(guī)檢查早期難以診斷；另一方面，早期臨床癥狀不顯著、腫瘤早期易轉(zhuǎn)移、對化療藥物不敏感，也是導(dǎo)致胰腺癌早期不易被診治的原因[4]。因此，尋找一個特異性強、敏感性高的生物靶點顯得尤為重要。

近年來有研究表明，miRNA作為獨立生物靶點在各種腫瘤中已被證實與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。miRNA是一類非編碼的微小RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平與靶mRNA結(jié)合，使其降解并抑制基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞一系列生物行為[6]。有研究報道，miR-345在小細(xì)胞肺癌、前列腺癌及肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-345能抑制上述腫瘤生物學(xué)性狀的改變，抑制腫瘤生長[7-9]。然而，針對胰腺癌的研究中，miR-345的相關(guān)報道還較少。本文重點探討miR-345在胰腺癌細(xì)胞中對腫瘤生物學(xué)特性增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和制劑 本實驗所選人胰腺癌細(xì)胞株分別為 AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990 及人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE，均購自美國ATCC細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)基1640、DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司，miR-345及U6引物由廣州銳博生物科技有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計及包裝，慢病毒載體（lv-miR-345-U）購自上海吉凱公司，細(xì)胞計數(shù)Kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Bcl-2抗體購自美國Abcam公司。

1.1.2 動物 所選擇的免疫缺陷小鼠均為雌性，年齡4周齡，體重14～15 g，均購自北京華阜康公司。

1.1.3 組織標(biāo)本 10對人胰腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2016年1—12月術(shù)后收集，并由病理確診為胰腺癌，置于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞株P(guān)ANC-1和MIA PaCa-2，含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞株HPDE、AsPC-1、BxPC-3、SW1990，上述細(xì)胞均放置于 37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 人胰腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織中及各胰腺癌細(xì)胞中miR-345的表達(dá) 根據(jù)總RNA抽提試劑（Trizol）說明書分別提取人胰腺癌組織和對應(yīng)癌旁組織及不同種類細(xì)胞株中的總RNA，將相對吸光度在1.8～2.0（A260/A280）的樣本用于該實驗。將各樣本以U6為內(nèi)參，分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為 70℃ 10 min，42℃ 50 min，70℃ 10 min，4℃保存。再將逆轉(zhuǎn)錄后的各樣本以U6作為內(nèi)參，分別擴增目的片段，其中實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)體系為 25 μL，反應(yīng)條件為 95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55℃30 s，70℃30 s，共45個循環(huán)。最后miR-345的表達(dá)量將采用相對定量法（RQ）來表示。

1.2.3 miR-345慢病毒感染及效率檢測 根據(jù)qRTPCR檢測結(jié)果選取2株胰腺癌細(xì)胞系，待這2株細(xì)胞系貼壁生長融合至70%～80%時，將原瓶貼壁細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化至新瓶進行傳代培養(yǎng)，根據(jù)各細(xì)胞感染復(fù)數(shù)（MOI）值加入慢病毒。本實驗分為2組：過表達(dá)組（lv-miR-345-U組）、陰性對照組[空載慢病毒載法（lv-NC）組]，培養(yǎng)1周后采用qRT-PCR檢測感染效率。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力 分別將2株細(xì)胞系的細(xì)胞密度調(diào)整為1×105mL-1，接種到96孔板中，每孔約加入細(xì)胞懸液100 μL，設(shè)置復(fù)孔5個，待其貼壁后分別于 0、24、48、72、96 h 加入含 10%CCK-8 的培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)液后3 h測定每孔在波長為450 nm時的吸光度。

1.2.5 平板克隆實驗檢測集落形成能力 分別收集處于對數(shù)生長期的2株細(xì)胞，細(xì)胞懸液密度調(diào)整為1×103mL-1，種植約2×103mL-1細(xì)胞到6孔板中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，統(tǒng)計每孔克隆形成數(shù)量。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤模型檢測體內(nèi)成瘤能力 將14只裸鼠隨機分至lv-NC組和lv-miR-345-U組中，每組7只，將處于對數(shù)生長期穩(wěn)定表達(dá)的lv-NC組和lv-miR-345-U組細(xì)胞進行收集，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸后與等量Matrigel基質(zhì)膠混合，將混合液密度調(diào)整為1×107mL-1，皮下注射200 μL混合液于每只裸鼠的右后腿部。2組在相同條件下飼養(yǎng)8周，8周后采用頸部脫臼法處死裸鼠，將裸鼠體內(nèi)瘤體取出，測定腫瘤體積（mm3）。

1.2.7 Ki-67在裸鼠腫瘤中的表達(dá) 裸鼠體內(nèi)腫瘤取出后用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色；將Ki-67一抗按1∶400稀釋后染色。每組腫瘤切片隨機選取5張，每張切片隨機選取3個視野，統(tǒng)計并拍照。

1.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blotting） 采用targetscan等生物信息網(wǎng)站預(yù)測miR-345的作用靶點，選取評分最高的潛在靶點，在前期工作中作者已選出Bcl-2可能是miR-345的潛在靶點，采用BCA法提取總蛋白，按50 μg上樣量計算出上樣體積，制作合適濃度的凝膠并進行電泳，孵育 Bcl-2（1∶500）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）一抗（1∶1 000），4℃搖床過夜，加入二抗室溫孵育2 h后采用辣根過氧化物酶底物（ECL電化學(xué)發(fā)光試劑）曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析、整理，計量資料以表示，2組間分析采用t檢驗，各組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖1 miR-345在胰腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 miR-345在體外對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.1 miR-345胰腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá) 10對胰腺癌配對組織中，miR-345在胰腺癌組織的表達(dá)量（1.13±0.21）明顯低于對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)量（4.53±0.68），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1A。5株胰腺癌細(xì)胞miR-345表達(dá)量與HPDE相比，均為低表達(dá)，其中AsPC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2、PANC-1、SW1990細(xì)胞株中miR-345的相對表達(dá)量分別為 0.34±0.05、0.71±0.06、0.49±0.09、0.31±0.01、0.26±0.06，均顯著低于 HPDE 細(xì)胞株（1.08±0.13），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1B。

2.2 miR-345慢病毒在胰腺癌中的感染效率 選取表達(dá)差異明顯的PANC-1和SW1990作為實驗所用細(xì)胞系，并感染慢病毒。2株細(xì)胞感染慢病毒后lv-miR-345-U組miR-345表達(dá)量均較lv-NC組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2A、2B。

圖3 miR-345在體內(nèi)對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miR-345對胰腺癌細(xì)胞增殖活力的影響 培養(yǎng)PANC-1和SW1990細(xì)胞96 h后，吸光度值lv-miR-345-U組較lv-NC組均明顯降低；其中PANC-1細(xì)胞系lvmiR-345-U組吸光度值為1.25±0.05，lv-NC組為2.22±0.15；SW1990細(xì)胞系lv-miR-345-U組吸光度值為1.49±0.07，lv-NC組為2.25±0.12，2株細(xì)胞系不同組別之間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2C、2D。

2.4 miR-345對胰腺癌細(xì)胞集落形成的影響 2株細(xì)胞系lv-miR-345-U組較lv-NC組集落形成數(shù)量均明顯減少，其中l(wèi)v-miR-345-U組集落形成數(shù)量PANC-1為86.67±14.62，SW1990 為 314.70±16.76；lv-NC 組集落形成數(shù)量 PANC-1為 417.00±19.97，SW1990為 814.00±34.12；2株細(xì)胞系比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2E、2F。

2.5 miR-345對胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響 取出的腫瘤體積lv-miR-345-U組較lv-NC組明顯變小，其中l(wèi)v-miR-345-U 組（82.71±16.25）mm3，lv-NC 組（223.60±23.60）mm3，2 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3A、3B。

2.6 miR-345對Ki-67表達(dá)的影響 lv-miR-345-U組Ki67表達(dá)量明顯低于lv-NC組，其中Ki-67的相對表達(dá)量 lv-miR-345-U 組為 0.15±0.02，lv-NC 組為 0.52±0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3C、3D。

2.7 miR-345對Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 Westernboltting結(jié)果顯示，lv-miR-345-U組Bcl-2的蛋白表達(dá)水平較lv-NC組明顯下調(diào)。見圖4。

圖4 miR-345對Bcl-2蛋白水平的影響

3 討 論

近年來，胰腺癌患病率逐年上升，預(yù)計到2030年，在致死性的腫瘤相關(guān)疾病中，胰腺癌將上升至第2位[10]。miRNA是一組由19～22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，其能通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[11]。miRNA作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，參與機體的各種生理功能，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等。miRNA的異常表達(dá)在疾病發(fā)生、發(fā)展包括腫瘤形成過程中起到了重要作用[11]。

國內(nèi)外大量研究表明，miR-345在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，miR-345在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-345表達(dá)量與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，表達(dá)量越低，患者預(yù)后越差；另一方面，在體外實驗中，過表達(dá)miR-345可通過直接作用于靶蛋白YAP1，使后者表達(dá)受到抑制（YAP1是一種“癌蛋白”，負(fù)責(zé)編碼hippo信號通路下游中的關(guān)鍵蛋白），最終導(dǎo)致肝癌MHCC-97H細(xì)胞系遷移能力增強[9]。也有研究報道，miR-345能通過直接靶向作用于IRF1調(diào)控的mTOR/STAT3/AKT信號通路，最終導(dǎo)致肝癌HCCLM3細(xì)胞系生物學(xué)特性減弱[12]。CHEN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-345在前列腺癌患者中低表達(dá)，并通過動物實驗和體外實驗證實miR-345能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，其潛在機制可能是miR-345直接作用靶蛋白Smad1，使其表達(dá)下降，異常表達(dá)的Smad1可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力增強。TANG等[14]研究指出，miR-345在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，低表達(dá)的miR-345往往與惡性的病理類型及早期的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，但miR-345對甲基化處理敏感，人為的甲基化處理可使miR-345表達(dá)水平升高，過表達(dá)miR-345又足以抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，胰腺癌與miR-345的相關(guān)報道還較少，所以，本研究的重點從體外實驗和動物實驗2個方面探討了miR-345對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。首先，作者檢測了miR-345在胰腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-345低表達(dá)，然后構(gòu)建了miR-345過表達(dá)和陰性對照組的慢病毒載體，并分別成功感染了2株胰腺癌細(xì)胞系，在體外實驗方面作者采用CCK-8、平板克隆分別檢測了miR-345對胰腺癌細(xì)胞增殖活力及集落形成能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-345過表達(dá)能抑制胰腺癌細(xì)胞的體外增殖；最后建立了裸鼠皮下成瘤模型，并將成瘤后的瘤體包埋切片進行免疫組織化學(xué)實驗，結(jié)果顯示miR-345能抑制胰腺癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤及抑制腫瘤增殖指標(biāo)Ki-67的表達(dá)；綜合體內(nèi)、體外實驗結(jié)果可以得出結(jié)論，miR-345能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，為作者進一步研究該抑制作用的深入機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。通過3種不同的生物信息預(yù)測網(wǎng)站，如Target scan、microRNA、org等預(yù)測了miR-345可能的潛在靶點，發(fā)現(xiàn)Bcl-2可能為miR-345在胰腺癌中直接作用的靶點。Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，該蛋白的功能之一是抑制細(xì)胞的凋亡。有研究表明，過表達(dá)Bcl-2能減少阿帕替尼導(dǎo)致的骨肉瘤細(xì)胞的自噬及凋亡[15]。在胰腺癌細(xì)胞中，抑制miR-1180的表達(dá)能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，其潛在的機制是下調(diào)miR-1180，抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活及下游Bcl-2蛋白的表達(dá)，最終抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[16]。因此，過表達(dá)miR-345在胰腺癌中可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其潛在機制可能是引起下游靶蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，進而加快腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本課題組的前期研究已證實miR-345能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，并采用western boltting檢測了miR-345能促進Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，進一步采用雙熒光素酶報告分析實驗驗證了Bcl-2是否為miR-345的直接作用靶點。另一方面，是否存在其他關(guān)鍵靶蛋白及是否激活某些通路（如ERK-MEK信號通路，瀑布式激活下游靶蛋白，最終導(dǎo)致ERK磷酸化激活，一部分直接入核調(diào)控增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)，促進轉(zhuǎn)錄，一部分調(diào)控細(xì)胞周期表達(dá)，促進G1期向S期轉(zhuǎn)變，促進細(xì)胞的增殖加快，或協(xié)同其他通路共同調(diào)控細(xì)胞增殖），其潛在機制還需進一步研究。

綜上所述，作者采用動物實驗、體外實驗分別探討了miR-345對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果提示miR-345能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，為進一步探討其潛在機制打下理論基礎(chǔ)，miR-345有望成為胰腺癌新型靶向治療藥物的生物靶點。

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