hp-MSCs對(duì)RSV引起小兒毛細(xì)支氣管炎的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

李得志 于欣欣 吳福玲 高萌 石濤

(1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256610； 2. 濱州市人民醫(yī)院兒科，山東 濱州 256610)

毛細(xì)支氣管炎是一種嚴(yán)重的喘息性疾病，具有咳嗽、咳痰發(fā)燒等典型的臨床表現(xiàn)，發(fā)病具有季節(jié)性[1]。毛細(xì)支氣管炎多見(jiàn)于2歲以下的嬰幼兒，由于新生兒較弱的免疫系統(tǒng)和發(fā)育不全的呼吸系統(tǒng)，使這一年齡段的嬰幼兒患毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病率明顯升高[2]。最近Wu P的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),小兒毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病率為68%，小兒毛細(xì)支氣管炎還伴有支氣管哮喘等一系列并發(fā)癥[3]，危害嚴(yán)重，給社會(huì)、家庭帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus , RSV)是引起小兒毛細(xì)支氣管炎最常見(jiàn)的的病原體，占發(fā)病的50%～80%[4]。此外，鼻病毒和博卡病毒等也可引起該病[5]。RSV可以通過(guò)促進(jìn)炎癥因子釋放引起呼吸道炎癥，同時(shí)可以破壞免疫系統(tǒng)[6]。以往研究認(rèn)為，RSV引起的小兒毛細(xì)支氣管炎與輔助性T淋巴細(xì)胞1 (help T cells，Th1)/輔助性T淋巴細(xì)胞2(help T cells，Th2)亞群比例失衡有關(guān)。最近動(dòng)物以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RSV還可引起輔助性T淋巴細(xì)胞17(help T cells，Th17)/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞 (regulatory T cells，Treg )亞群比例失衡，而Th17/ Treg比例失衡同樣參與嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[7]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類(lèi)多潛能干細(xì)胞，存在于幾乎所有器官和結(jié)締組織間質(zhì)中。以往研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有抗炎和促進(jìn)組織修復(fù)的作用[8-9]。而同時(shí)大量研究證實(shí)了人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(human placental multipotent mesenchymal stromal cells ，hp-MSCs)對(duì)炎癥介質(zhì)釋放具有抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，hp-MSCs可以抑制毛細(xì)支氣管炎模型鼠的支氣管炎癥反應(yīng)。但是hp-MSCs水平與小兒毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病是否相關(guān)以及 hp-MSCs抑制小兒毛細(xì)支氣管炎癥機(jī)制還不明確。因此，本研究旨在觀察hp-MSCs對(duì)小兒毛細(xì)支氣管炎的影響，并探討 hp-MSCs抑制毛細(xì)支氣管炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究于2014～2015年在濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院招募志愿者，并收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院出生的新生兒胎盤(pán)，隨后對(duì)出生后的新生兒進(jìn)行隨訪，由兒科大夫根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷受試者是否為毛細(xì)支氣管炎患者，以毛細(xì)支氣管炎患者為病例組，正常體檢兒童為對(duì)照組，進(jìn)行病例對(duì)照研究。按照胎齡、性別、居住地和喂養(yǎng)方式進(jìn)行1:1匹配。胎盤(pán)由產(chǎn)科大夫收集，無(wú)菌條件下取足月剖宮產(chǎn)兒胎盤(pán)，剖出羊膜，剪取胎兒側(cè)胎盤(pán)組織，PBS(磷酸緩沖液)反復(fù)沖洗至干凈，放入液氮凍5min，然后轉(zhuǎn)移至-80°冰箱進(jìn)行保存。本研究共獲取44名研究對(duì)象的既往體檢資料(年齡、居住地、聯(lián)系電話、家族史、個(gè)人史、喂養(yǎng)史、治療情況等)，其中男性22人，女性22人。

1.2 hp-MSCs水平檢測(cè) 取出胎盤(pán)組織，用眼科剪剪碎。剪碎的組織稱(chēng)取5g，加入1g/L的膠原酶Ⅱ，37℃下消化45min，然后經(jīng)過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液。離心，棄上清，以8．3 g/L氯化銨溶液4 ml 重懸細(xì)胞，1000 r/min離心 5 min，棄上清，PBS洗滌2次。以完全培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液，錐蟲(chóng)藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hp-MSC表面標(biāo)志整合素家族成員CD29(Cluster of differentiation29，CD29)和透明質(zhì)酸受體CD44(Cluster of differentiation44，CD44)表達(dá)水平[10]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；利用免疫磁珠法進(jìn)一步從單個(gè)核細(xì)胞中分離CD4+T淋巴細(xì)胞；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞的純度,利用2%錐蟲(chóng)藍(lán)鑒定活細(xì)胞數(shù)。將分離獲取的細(xì)胞調(diào)整為2×106個(gè)/ml，取相同數(shù)量的CD4+T淋巴細(xì)胞分為對(duì)照組、RSV感染組和RSV+hp-MSCs干預(yù)組等3個(gè)亞組，分別給予相應(yīng)的干預(yù)。

1.4 hp-MSC對(duì)炎癥因子分泌的影響 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked ligand sorbent assay ，ELLSA)檢測(cè)炎癥因子水平，并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 觀察hp-MSC對(duì)Foxp3及RORγt基因表達(dá)的影響 采用Real time PCR法檢測(cè)Foxp3和RORγt基因水平。稱(chēng)取各組細(xì)胞，使用超聲破碎儀將組織粉碎后裂解，提取RNA，變性，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Foxp3 和 RORγt 引物序列Table 1 Primers for PCR amplification of Foxp3 and RORγt gene

1.6 觀察hp-MSC對(duì)Foxp3及RORγt蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)，取60mg全細(xì)胞蛋白電泳樣品進(jìn)行電泳分析，電泳條件：4°C，開(kāi)始時(shí)電壓120V，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)到80V。電泳結(jié)束后，進(jìn)行蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜，蛋白從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉PVDF膜，蛋白質(zhì)與一抗反應(yīng)，蛋白質(zhì)與二抗反應(yīng)，顯色，觀察結(jié)果，用掃描儀掃描照片并用Fluorchem FC2軟件進(jìn)行圖像分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)作為內(nèi)參照，用目的蛋白與相應(yīng)的GAPDH條帶平均光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 hp-MSCs與嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎的相關(guān)性

2.1.1 病例組和對(duì)照組基本情況比較 兩組人群基本情況以及是否有特異性皮炎，是否存在毛細(xì)支氣管炎1級(jí)、2級(jí)家族史，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 兩組人群的人口學(xué)特征(n,×10-2)Table 2 Demographic characteristics

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05， ②P<0.01

2.1.2 病例組與對(duì)照組hp-MSCs及表面標(biāo)記物表達(dá)水平比較 對(duì)照組hp-MSCs水平高于病例組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)照組hp-MSCs 表面標(biāo)記物CD44和CD29表達(dá)水平高于病例組，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組嬰幼兒胎盤(pán)hp-MSCs數(shù)量及表面標(biāo)記物表達(dá)水平比較Table 3 Expression of hp-MSCs and its surface markers in infants with nomal and with capillary bronchitis

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.2 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)的影響

2.2.1 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-9的影響 與對(duì)照組相比，RSV感染可以升高IL-9水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以降低IL-9水平，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.2.2 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-17的影響 與對(duì)照組相比，RSV感染可以升高IL-17水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以降低IL-17水平，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-9濃度的影響

Figure1Effectofhp-MSCsonIL-9secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01

圖2 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-17濃度的影響

Figure2Effectofhp-MSCsonIL-17secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01

2.2.3 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-10的影響 與對(duì)照組相比，RSV感染可以降低IL-10水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以升高IL-10水平，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-10濃度的影響

Figure3Effectofhp-MSCsonIL-10secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01

2.2.4 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌TGF-β1的影響 與對(duì)照組相比，RSV感染可以降低TGF-β1水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以升高TGF-β1水平，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 hp-MSCs對(duì)人CD4+T淋巴細(xì)胞分泌TGF-β1濃度的影響

Figure4Effectofhp-MSConTGF-β1secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對(duì)照組相比①P<0.05，②P<0.01

2.3 hp-MSCs對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞Th17/Treg平衡的影響

2.3.1 hp-MSCs對(duì)Foxp3蛋白和基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，RSV感染可以上調(diào)Foxp3蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。與對(duì)照組相比，RSV感染可以上調(diào)Foxp3基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以下調(diào)Foxp3基因表達(dá)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖5 Western-blot方法檢測(cè)hp-MSCs對(duì)Foxp3表達(dá)水平的影響Figure 5 Effect of hp-MSCs on Foxp3 expression by Western-blot注：與對(duì)照組相比，① P<0.05，②P<0.01

圖6 檢測(cè)hp-MSCs對(duì)Foxp3基因表達(dá)水平的影響

Figure6Effectofhp-MSCsonFoxp3geneexpressionbyRealtimePCR

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01

2.3.2 hp-MSCs對(duì)RORγt蛋白和基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，RSV感染可以上調(diào)RORγt蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以下調(diào)RORγt蛋白表達(dá)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖7。與對(duì)照組相比，RSV感染可以上調(diào)RORγt基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預(yù)可以下調(diào)RORγt基因表達(dá)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

圖7 檢測(cè)hp-MSCs對(duì)RORγt表達(dá)水平的影響

Figure7Effectofhp-MSCsonRORγtexpressionbyWestern-blot

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01

圖8 檢測(cè)hp-MSCs對(duì)RORγt基因表達(dá)水平的影響

Figure8Effectofhp-MSCsonRORγtgeneexpressionbyRealtimePCR

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

研究已經(jīng)證實(shí)，嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎發(fā)病可引起炎癥介質(zhì)釋放增多，并可進(jìn)一步引起支氣管哮喘等并發(fā)癥[11]。Chen CP等研究發(fā)現(xiàn)，hp-MSCs不僅可以抑制IL-9等促炎癥介質(zhì)釋放，還可增加IL-10等抗炎癥介質(zhì)的釋放[12]，提示胎盤(pán)中的hp-MSCs水平可能與嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病存在密切聯(lián)系。但是至今無(wú)臨床研究證實(shí)hp-MSCs水平降低與嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎發(fā)病存在聯(lián)系。本研究第一次通過(guò)臨床研究觀察hp-MSCs水平與嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎發(fā)病的相關(guān)性，結(jié)果表明，hp-MSCs水平下降是引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

人群研究已經(jīng)證實(shí)了嬰幼兒hp-MSCs水平下降可以引起毛細(xì)支氣管炎，說(shuō)明hp-MSCs具有保護(hù)作用。那么hp-MSCs是如何防治毛細(xì)支氣管炎的呢？為此，本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞研究。通過(guò)分離hp-MSCs和CD4+T淋巴細(xì)胞并進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，RSV明顯升高IL-9、IL-17等促炎癥因子的水平，同時(shí)降低IL-10、TGFβ-1等抗炎因子水平。而hp-MSC干預(yù)可以明顯降低IL-9、IL-17等促炎癥因子的水平，升高IL-10、TGFβ-1等抗炎因子水平。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果相似。2011年，上海交通大學(xué)新華醫(yī)院管小俊通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肺內(nèi)輸入MSCs可以降低肺氣腫模型鼠的炎癥因子釋放[13]。Gu YZ團(tuán)隊(duì)通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hp-MSCs可以降低γ-干擾素(interferon-gamma, IFN-γ)的水平，同時(shí)提高IL-10等抗炎因子的水平。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)論相反的研究報(bào)道[14]。

Th17與Treg細(xì)胞之間的平衡對(duì)毛細(xì)支氣管炎發(fā)生起到重要作用，Treg不僅可以抵御各種病毒入侵，還可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)和增加免疫耐受，起到預(yù)防毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生作用[15-16]。而Th17可以通過(guò)分泌IL-17等炎癥介質(zhì)促進(jìn)毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生[17]。而以往研究證實(shí),Foxp3 與 RORγt之間的平衡決定CD4+T細(xì)胞的分化方向[18]，F(xiàn)oxp3表達(dá)上調(diào)可以抑制RORγt表達(dá)，繼而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Treg分化，抑制CD4+T向Th17分化。反之Foxp3表達(dá)下調(diào)可以上調(diào)RORγt表達(dá)，繼而抑制CD4+T細(xì)胞向Treg分化[19]，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17分化。Foxp3 與 RORγt的穩(wěn)態(tài)受到破壞可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生，引起Th17分泌IL-17等炎癥因子增加，引起毛細(xì)支氣管炎[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV病毒干預(yù)可以下調(diào)Foxp3蛋白和基因，上調(diào)RORγt蛋白和基因，引起CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17分化，促進(jìn)毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生。而hp-MSCs的干預(yù)可以反轉(zhuǎn)RSV病毒引起一系列炎癥反應(yīng)，起到防治毛細(xì)支氣管炎的作用。本研究與以往研究結(jié)果相似。Obermajer N研究發(fā)現(xiàn)，在器官移植手術(shù)中，MSCs可以抑制CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化[19]。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)論相悖的報(bào)道，證明了hp-MSC是通過(guò)調(diào)節(jié)Th17與Treg細(xì)胞平衡達(dá)到抑制炎癥因子釋放和促進(jìn)抗炎因子的分泌，起到防治毛細(xì)支氣管炎的作用。本研究同樣存在一些不足，比如以往研究顯示，Th1/Th2的平衡紊亂也可引起毛細(xì)支氣管炎[21]，因此，還需進(jìn)一步觀察hp-MSC對(duì)Th1/Th2平衡紊亂的影響。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，hp-MSCs表達(dá)水平降低是引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，hp-MSCs通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡繼而上調(diào)Foxp3蛋白和基因的表達(dá)，以及下調(diào)RORγt蛋白和基因表達(dá),進(jìn)而起到防治嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎的作用。

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