NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-18/IL-1β-TGF-β信號通路與Ⅱ型糖尿病臨床相關性研究*

胡龍江 周音頻 曹運蘭 呂湛 藍運競 寧琳 向立權 肖鵬

(1.重慶市涪陵中心醫院心血管內科，重慶 涪陵 408000；2.貴州省人民醫院心血管內科，貴州 貴陽 550002；3.川北醫學院附屬醫院心血管內科，四川 南充 637000)

目前，Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為全球化的流行性疾病，其慢性進行性病程及產生的多種急慢性并發癥，嚴重影響著患者的生活質量。最近流行病學調查顯示，我國T2DM的患病率已達9.7%，糖尿病前期人群已達15.5%。因此，闡明T2DM的發病機制、開發新的有效防治方法是目前醫學界亟待解決的難題和熱點。最近研究證實，T2DM的發生與機體固有免疫系統介導的炎癥反應密切相關，T2DM的免疫防治作為新興治療途徑而備受關注。NLRP3炎性小體能感受代謝性應激信號的刺激，從而導致caspase-1活化及一系列炎性因子的產生，與T2DM的發生發展密切相關，而當機體炎性因子如白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)增加時，機體的抗炎因子如轉化生長因子(transfor-ming growth factor-β,TGF-β)亦會發生變化。本文就以核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-bmding oligomerization domain-like receptor protein3,NLRP3)炎性小體為中心的NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-18/IL-1β-TGF-β信號通路在T2DM發生發展過程中的作用進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月～2017年3月，在我院健康體檢中心收集健康對照組30例，內分泌科收集T2DM組40例，年齡30～80歲，對照組符合肝心腎肺檢查均正常，排除T2DM(診斷依據為1999年WHO制定的糖尿病診斷分型標準)、急性和慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、痛風、近期創傷、正在使用抗炎藥物者及其他代謝性疾病，排除家族中有傳染病及遺傳病史者。T2DM組符合患初診T2DM(診斷依據同上)，未使用降糖、降脂藥物治療者，亦未正規采用飲食及運動療法者,排除1型糖尿病(在30歲以前診斷為糖尿病并使用胰島素治療)、內分泌相關糖尿病及T2DM合并急性并發癥(如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病乳酸酸中毒)、嚴重慢性并發癥(如心肝腎功能不全、急性和慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、痛風)和近期創傷、正在使用抗炎藥物者以及其他代謝性疾病者。所有操作程序由涪陵中心醫院倫理委員會批準，入選對象均對本研究內容知曉并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑 Step One Plus 熒光定量PCR測定儀(新加坡ABI公司)，PTC-2000PCR測定儀(美國MJR公司)，Neofuge1600R臺式高速冷凍離心機(香港力康科技有限公司)，AllegraTM64R高速臺式離心機(美國BECKMAN公司)，LAS 4000mini 凝膠成像系統(美國GE公司)，NANODROP2000超微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)，電泳裝置(美國Bio-rad公司)，酶標儀(美國Emax公司)，HB-100恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，隔水式電熱恒溫培養箱(重慶帝凡商貿)；人淋巴細胞分離液由北京達科為生物技術有限公司提供，PrimeScriptTMRT reagent Kit、RNAiso plus試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒均由Takara公司提供，Anti-NLRP3 antibody、Anti-TMS1 antibody、Anti-Caspase-1 antibody均由abcam公司提供，western及IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均由上海碧云天生物有限公司提供，人IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒均由上海廣銳生物科技有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 基本資料及臨床生化資料采集 收集所有研究對象的性別、年齡、吸煙史、血壓、身高、體重等基本資料，并計算出平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)、體重指數(body mass index,BMI)，所有研究對象均隔夜空腹8h以上，次日清晨空腹抽取肘靜脈血20ml，取2ml全血離心獲得血漿后置-80℃冰箱備用。剩余全血應用人淋巴細胞分離液，采用Ficoll-Hypaque密度梯度分離法分離出T2DM組和對照組人PBMCs備用，操作嚴格按試劑盒說明書進行。在我院檢驗科檢測所有入選對象的FPG、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋的膽固醇(Low density liporotein cholesterol, LDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇(very low density lipoprotein cholesterol，VLDLC)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)等生化資料。

1.3.2 RNA提取及逆轉錄 應用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA，操作嚴格按試劑盒說明書進行，采用分光光度儀測定RNA濃度及純度，均符合要求后，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit進行逆轉錄反應，合成cDNA，操作嚴格按試劑盒說明書進行。引物序列見表1，由Takara公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.3 RT-qPCR反應 應用SYBR Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒進行實時定量PCR反應，反應體系按照說明書配制，反應條件為95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，50個循環。反應結束后，作擴增及溶解曲線，每個樣本均設置3個復孔，取均值統計數據，采用Ct值計算目的基因的相對表達量：△△Ct=(CtT2DM組-CtGAPDH)-(Ct對照組-CtGAPDH)，病例組目的基因mRNA的相對表達量= 2-△△Ct。

1.3.4 Western blot 按照western及IP細胞裂解液說明書操作提取人PBMCs總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。取40μg蛋白進行8%SDS-PAGE凝膠電泳(條件：80V 30min，100V 60min)，裁剪適合寬度的PDVF膜，甲醛浸泡15s，轉膜60min，BSA封閉液室溫封閉4h，浸入含蛋白NLRP3(1:100)、ASC(1:1000)，Caspase-1(2.5μg/ml)、內參蛋白GAPDH(1:500)的一抗稀釋液中， 4℃孵育過夜，次日TBST緩沖液洗膜5min，5次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:5000)，室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜5min(6次，凝膠成像分析系統掃描蛋白條帶，蛋白相對表達量=目的蛋白/內參蛋白GAPDH。實驗重復3 次，取均值統計數據。

1.3.5 ELISA檢測 采用人IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒，嚴格參照說明書操作，反應終止后，酶標儀測定450nm處的吸光度值(OD值)，根據試劑盒提供的標準品濃度及測定的OD值作標準曲線，計算各組血漿樣本濃度，每個血漿樣本均設置2個復孔，取均值統計數據。

2 結果

2.1 兩組基本情況及血脂、血糖水平變化比較 兩組性別、年齡、吸煙、MAP、TC、LDLC無顯著性差異(均P>0.05)；T2DM組BMI、FPG、HbA1c、TG、VLDLC高于對照組，HDLC低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

Table2Comparisonoftheplasmalevelsofglucose,lipoproteinsandgeneraldata

變量對照組T2DM組性別(男/女)16/1426/14吸煙(是/否)5/256/34年齡(歲)59．40±8．8061．65±8．95BMI(kg/m2)24．24±2．5526．00±2．90①MAP(mmHg＂)90．83±11．6494．67±10．80FPG(mmol/L)4．70±0．637．15±2．59①HbA1c(×10-2)5．77±0．366．94±0．70①TG(mmol/L)1．29±0．551．84±1．21①TC(mmol/L)4．27±1．054．12±1．21HDLC(mmol/L)1．24±0．301．09±0．23①LDLC(mmol/L)2．73±0．862．37±0．82VLDLC(mmol/L)0．59±0．250．84±0．55①

注：與對照組比較，①P<0.05

2.2 兩組血漿IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 T2DM組IL-1β、IL-18、TGF-β高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.3 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平比較 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平在PBMCs中的表達差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

Table3ComparisonoftheplasmalevelsofIL-1β,IL-18andTGF-βbetweenT2DMgroupandcontrolgroup

變 量對照組T2DM組IL?1β(ng/L)IL?18(ng/L)TGF?β(ng/L)12 53±2 7950 02±10 181538 33±262 1922 86±1 66①144 14±14 20①2131 38±302 10①

注：與對照組比較，①P<0.05

2.4 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1水平比較 T2DM組NLRP3、ASC、Caspase-1 在PBMCs中的表達均較對照組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

2.5 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA水平與各變量的Spearman相關性分析 結果顯示，NLRP3mRNA在對照組、T2DM組均無相關性；ASCmRNA在對照組無相關性，在T2DM組與TC呈正相關，相關系數為0.466(P=0.038)；Caspase-1mRNA在對照組與FPG呈正相關，相關系數為0.394(P=0.031)，在T2DM組與BMI呈正相關，相關系數為0.463(P=0.040)。

圖1 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平比較Figure 1 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1mRNA in T2DM group and control group注：與對照組比較，①P<0.05

圖2 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1水平比較Figure 2 Expression of NLRP3, ASC and Caspase-1 in T2DM group and control group注：與對照組比較，①P<0.05

2.6 兩組NLRP3、ASC、Caspase-1與各變量的Spearman相關性分析 結果顯示，NLRP3在對照組與性別呈正相關，相關系數為0.429(P=0.020)，在T2DM組無相關性；ASC在對照組與FPG呈正相關，相關系數為0.405(P=0.026)，在T2DM組與MAP、FPG、TC、IL-1β、IL-18呈正相關，相關系數分別為0.465(P=0.039)、0.626(P=0.003)、0.564(P=0.010)、0.502(P=0.024)和0.480(P=0.032)；Caspase-1在對照組與MAP、FPG呈正相關，相關系數分別為0.447(P=0.013)、0.396(P=0.030)，在T2DM組與吸煙、FPG、LDLC 、IL-1β呈正相關，相關系數分別為0.546(P=0.013)、0.585(P=0.007)、0.662(P=0.010)和0.624(P=0.003)。

圖3 兩組Western blot檢測結果

Figure3ResultsofWesternblotinT2DMgroupandcontrolgroup

2.7 IL-1β、IL-18、TGF-β之間Spearman相關性分析 結果顯示，IL-1β在T2DM組與TGF-β呈正相關，相關系數為0.564(P=0.010)，3者之間在對照組無相關性。

3 討論

T2DM是一種由胰島β細胞受損分泌胰島素減少和胰島素抵抗導致的慢性炎性疾病，但T2DM 發病機制目前尚不完全清楚。近年來，隨著固有免疫研究的迅速進展，有關固有免疫細胞炎性途徑介導的炎癥反應在自身免疫炎癥性疾病中的作用越來越受到關注。NLRP3炎性小體是由NLRP3、ASC和無活性的caspase-1前體(pro-caspase-1)組成的多蛋白復合體，是機體固有免疫系統的一員，是炎性免疫反應的重要組成部分，是炎癥-免疫的橋梁。其活化需要NLRP3氨基端熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)，通過PYD-PYD 之間的相互作用結合ASC，再由ASC 通過CARD-CARD之間相互作用招募無活性的pro-caspase-1，最后炎癥小體生成，并對caspase-1進行自身激活，活化后的caspase-1 將對pro-IL-1β、pro-IL-18等底物進行切割，以促進炎性因子IL-1β 和IL-18 的成熟及分泌[1-3]。

IL-18是活化的單核巨噬細胞分泌的一種前炎癥因子，在T2DM的發生發展過程中起中心介質作用，在T2DM前期即出現升高，可作為T2DM發生、病情變化及預后的預測因子，并且與T2DM心血管并發癥有關[4]，是T2DM并發心血管事件的一個預測因子。IL-1β是NLRP3炎性小體活化后產生的主要炎性分子。正常情況下，短暫的血糖水平升高引起急性、低劑量IL-1β產生，刺激胰島β細胞增殖和胰島素分泌，抑制食欲，減少攝食，從而維持外周血糖水平的穩定[5]。但是在慢性高血糖狀態下，T2DM患者體內IL-1β持續升高，其受體表達上調，一方面 IL-1β可引起β 細胞凋亡，其功能衰退及胰島素抵抗[6-7]；另一方面，IL-1β 和其他炎性因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等協同干擾體內葡萄糖代謝平衡[8]。因此，IL-1β在T2DM 的發生發展中起著重要作用[9]，被認為是T2DM的重要驅動者。而糖代謝紊亂作為危險信號進一步激活IL-1β 的平臺NLRP3 炎性小體。TGF-β是一類蛋白質超家族，在機體通過抑制白細胞的募集，降低巨噬細胞的功能[10]，減少單核巨噬細胞的趨化聚集，維持外周調節T細胞的作用，抑制T細胞向Th1和Th2增殖、激活和分化[11]等機制抑制炎性反應。但其過度表達，將會促進T2DM并發癥的發生發展，其機制包括促進細胞外基質成分的合成與積聚，抑制細胞外基質的降解[12-13]，促進平滑肌細胞的增生、遷移、分化[13-14]，誘導血管重構[12-13]，刺激內皮細胞合成纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitors, PAI)等細胞因子而促進血栓形成[13]，促纖維化作用增加纖維帽厚度等。

本研究顯示，初診T2DM 患者血漿中的炎性因子IL-1β、IL-18 和抗炎因子TGF-β水平顯著高于對照組，提示T2DM患者存在慢性炎癥反應；初診T2DM 患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA的表達與對照組比較無顯著性差異，但ASCmRNA及 Caspase-1mRNA在T2DM組分別與TC、BMI呈正相關，提示雖然T2DM患者NLRP3炎性小體在轉錄水平的表達無顯著性增加，但T2DM患者的血脂代謝異常、肥胖因素已經存在促進NLRP3炎性小體表達的傾向；初診T2DM 患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1的表達均較對照組顯著增高，并且ASC在T2DM組與MAP、FPG、TC呈正相關， Caspase-1在T2DM組與吸煙、FPG、LDLC呈正相關，一方面提示T2DM患者炎性小體在翻譯水平的表達明顯增加，為NLRP3蛋白復合體在T2DM患者中激活創造物質條件；另一方面提示T2DM患者高血壓、高血糖、TC、LDLC、吸煙是激活NLRP3炎性小體在翻譯水平表達增加的危險因素，但激活NLRP3炎性小體在翻譯水平表達增加的危險因素不盡相同。NLRP3炎性小體表達增加后，T2DM患者體內高血糖[15]、活性氧(ROS)[15]、硫氧還原蛋白結合蛋白[16]、神經酰胺濃聚物[17]、胰島淀粉樣多肽[18]等物質將通過半通道依賴途徑[19]、溶酶體依賴途徑[20]、ROS的依賴途徑[21-22]等模式激活NLRP3炎性小體。另外，在T2DM組，ASC還與IL-1β、IL-18呈正相關， Caspase-1還與IL-1β呈正相關，且IL-1β與TGF-β呈正相關，提示NLRP3炎性小體的激活，進一步導致IL-1β 和IL-18等炎性分子的表達增加，而IL-1β的表達增加將促使抗炎因子TGF-β的過度表達，IL-1β 和IL-18等炎性分子的表達增加及TGF-β等抗炎因子的過度表達，在T2DM及其并發癥的發生發展過程中起著重要作用。

由此可見，高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、肥胖是激活NLRP3炎性小體表達的重要危險因素，NLRP3炎性小體激活后進一步促進IL-1β、IL-18等炎性分子的表達及TGF-β等抗炎因子的表達，NLRP3 炎性小體是糖代謝紊亂誘導T2DM 發生發展的中心環節。加強對血脂、血壓、血糖水平的控制及煙、減肥，阻斷NLRP3炎性小體的表達及活化途徑，可能對T2DM及其并發癥的發生發展起到抑制作用。進一步研究NLRP3炎性小體激活及其調控機制，研究IL-18、IL-1β、TGF-β在T2DM發生發展過程中的作用，有望進一步明確T2DM及其并發癥在細胞和分子水平的發病機制，為T2DM的臨床診斷、療效觀察、預后判斷提供新的實驗室檢測指標，為T2DM及其并發癥的治療和預防提供新的突破點。

4 結論

高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、肥胖是激活NLRP3炎性小體表達的重要危險因素。以NLRP3炎性小體為中心的NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-18/IL-1β-TGF-β信號通路可能在初診T2DM的發生發展過程中發揮重要作用。

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