實驗小豬急性心肌梗死后心肌細胞凋亡機制的動態研究*

孫維娜 王紹欣 董平栓 汪硯雨 王可 李轉珍 魏麗娟 閆鵬 劉向勇 程建新 王麗平 段娜娜 王闖

(河南科技大學第一附屬醫院心血管內科，河南 洛陽471003)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是急性起病、發展迅速并死亡率高的心血管疾病，近年大量研究表明,AMI后的心肌細胞中存在有細胞凋亡[1]，并與AMI的預后及演變有關。細胞凋亡是基因調控的程序性死亡，是機體產生變化或者受到刺激時在基因調控及信號轉導下引起的一系列連鎖反應。目前國內外有大量心肌細胞凋亡相關的研究，但對其心梗后心肌凋亡的動態演變研究較少。本研究通過建立中華小豬急性心肌梗死模型后對心肌梗死的缺血區心肌細胞的凋亡指數(AI)及心肌組織中caspase-3蛋白的表達進行動態觀察并分析其變化規律，從而探討AMI后心肌細胞凋亡的機制。

1 對象及方法

1.1 實驗對象 健康中華小豬8只，由泰州泰和生物技術有限公司提供，均同窩出生，體重15～21kg，雌雄各半，全部經防疫檢驗合格，檢疫證號：3205197447，許可證號：SCXK(蘇)2011-0002。排除近期患病、體質差及進食不佳的小豬。

1.2 分組及建模 分組：選取其中1只小豬作為對照組，余7只小豬作為實驗組并隨機分成7個亞組，給予編號1～7組，分別對應心梗后1、3、5、7、10、14及28d的小豬，所有小豬均正常喂養，飲食、室溫均相同。建模：將小豬禁食水8～12h后，行肌肉注射誘導麻醉(氯胺酮)，并備皮固定于手術臺上，同時給予吸氧、心電監護并建立靜脈通路，消毒鋪巾，穿刺部位(右側股動脈搏動最強點)局部麻醉，沿右側股動脈處穿刺進針并送入J型導引導絲及6F動脈鞘管，追加肝素后將Guiding導管送入升主動脈根部，行左右冠狀動脈多體位造影。將Runthrough微導管遠端送入OM支近端，撤出導絲，將明膠海綿混懸液(明膠海綿溶于造影劑碘普羅胺內)經微導管推入，造影顯示OM支遠端血流中斷，撤出微導管，拔鞘管，置入人工套管，肝素封閉創口并壓迫6 h，術畢。對照組僅行冠脈造影術。在整個手術過程中小豬心率維持在120～200 次/min，血壓維持在140～180/110～150mmHg(心電監護顯示)。手術結束后，將動物送回飼養中心，單豬飼養，避免感染并注意觀察生命體征變化。

1.3 備制標本 在成功建立AMI模型后，分別于AMI后第1、3、5、7、10、14及28 d處死實驗組小豬并取出8只小豬的整體心臟，經4%的甲醛固定后于左室側壁切取不同部位的梗死缺血區及對照組正常心肌各3塊組織，經脫水、石蠟包埋后切片(每塊組織均切5張切片)，脫蠟，行TUNEL檢測及caspase-3免疫熒光檢測。TUNEL試劑盒購于美國羅氏abcam公司 In Site Death TMR紅色標記，編號：12156792910；caspase-3兔抗購于上海優寧維生物科技有限公司，貨號：ab90437。

1.4 實驗步驟

1.4.1 TUNEL法檢測 按照TUNEL試劑盒說明書進行。將組織切片放入干燥箱2h，再依次進行組織脫蠟、抗原修復、甲醇-H2O2阻斷液、TUNEL試劑混合液(按抗體混合液：PBS為1:2，其中紅：藍為45:5，抗體在暗濕盒中孵育1h，37℃)、DAPI染液(按每張組織切片50～100μl 時間10～15min)、覆蓋玻片及中性樹膠封片(從阻斷液后均避光)，將暗濕盒中的切片置于4℃冰箱中保存過夜，每步前后均用PBS洗滌3次×5min，于×40倍電子熒光顯微鏡下觀察心肌凋亡數目及細胞核的情況并攝片記錄。

1.4.2 Caspase-3免疫熒光 caspase-3免疫熒光檢測一抗為兔抗豬多克隆抗體，二抗為通用型二抗兔抗鼠免疫熒光試劑盒。先將組織切片放入干燥箱中2h，再依次進行脫蠟、抗原修復、甲醇-H2O2阻斷液、10%山羊血清封閉(山羊血清用PBS稀釋為1:9，時間10min)、一抗孵育(用抗體稀釋液稀釋為1:800， 4℃過夜，棄去血清直接滴加)、二抗孵育(用抗體稀釋液稀釋為1:200， 孵育1h， 37℃)、DAPI染液(按每張組織切片50～100μl，時間10～15min)、覆蓋玻片及中性樹膠封片(從一抗孵育后均避光)封片，4℃冰箱避光保存，每步前后均用PBS洗滌3次×5min，于×40倍電子熒光顯微鏡下觀察caspase-3的表達情況并攝片。

1.5 觀察指標 TUNEL法檢測：在顯微鏡觀察下任選陽性集中表達區域的10個視野，通過Photoshop-13-LS3軟件進行計數及圖片整理，統計視野中陽性指標數目與所占總心肌細胞數目百分比的平均值作為凋亡指數(AI),以定量評價心肌的凋亡程度。免疫熒光：按照caspase-3陽性表達密度依次從0、20%、40%、60%、80%、100%進行統計，同時計算其平均值。

2 結果

2.1 AMI 模型成功建立 實驗組小豬在局麻下行冠脈造影及OM支明膠海綿封堵術后，通過對比術前冠脈造影結果，顯示OM支遠端血流中斷，AMI模型建立成功，見圖1。

圖1 建立模型前后冠脈血流情況Figure 1 Coronary blood flow condition before and after the model注：a為實驗組行冠脈封堵術前，可見血流通暢；b為實驗組冠脈封堵術后，可見局部血流消失

2.2 TUNEL法檢測結果 AMI模型建立成功后，行TUNEL法檢測，結果顯示，正常未梗死心肌(對照組)未見陽性復合物表達，見圖2a；AMI后實驗組第1d即出現明顯陽性表達，同時即為高峰，而后逐漸下降，于第3～7d基本平穩，隨后至第14～28d基本降至偏低水平，見圖2b～h和圖3。

2.3 caspase-3免疫熒光檢測結果 在熒光顯微鏡下觀察caspase-3抗體復合物的陽性表達見圖4。實驗組及對照組各切片的陽性表達結果見圖5。

3 討論

本實驗通過成功建立AMI實驗小豬模型，分別對不同時期心肌梗死周邊缺血區行TUNEL檢測及caspase-3蛋白免疫組化檢測。從實驗圖片中可見梗死后心肌細胞核與未梗死細胞核相比，出現明顯細胞核體積減小及固縮現象，證實心肌細胞凋亡存在；TUNEL檢測結果顯示，AMI后第1 d AI達高峰，表明心肌梗死周邊缺血區存在大量凋亡細胞，這與 Eeva等[1]實驗結果相一致。隨后AI逐漸下降，在第7d左右處于短期平衡狀態，這正是心肌梗死后炎癥反應時期，同時心肌細胞也處于逐漸修復過程中。在AMI后第14～28 d左右心肌處于肉芽及瘢痕組織修復過程中，凋亡細胞處于低水平狀態。TUNEL法檢測及免疫熒光的陽性指標動態演變趨勢大致相同，這進一步證實心肌細胞在AMI后從凋亡、細胞壞死、炎癥反應及修復等一系列復雜的病理變化過程。

圖2 顯微鏡下AMI后心肌細胞不同時期的TUNEL檢測結果Figure 2 After AMI, TUNEL of myocardial cell in different periods注：a 指心肌細胞核，b 指陽性結果,b～h分別指AMI后第1、3、5、7、10、14、28d的TUNEL檢測結果

圖3 AMI后心肌細胞不同時期的AIFigure 3 AI of myocardial cells in different periods after AMI注：橫坐標為AMI后不同時期，即心梗后第1、3、5、7、10、14、28d；縱坐標表示凋亡指數

圖4 AMI后心肌細胞的Caspase-3免疫熒光檢測檢測結果Figure 4 Caspase-3 immunofluorescence result of myocardial cells after AMI注：a表示對照組免疫熒光結果,未見陽性表達，藍色表示細胞核；b表示心梗后第3d的陽性表達，其中桃紅色表示Caspase-3抗原抗體復合物

圖5 AMI后心肌細胞AI及Caspase-3免疫熒光結果

Figure5AIandCaspase3immunofluorescenceofmyocardialcellsafterAMI

注：橫坐標為AMI后不同時期；縱坐標藍色線表示凋亡指數(AI)，紅色線表示免疫組化Caspase-3陽性表達

國內外研究表明，急性心肌梗死后出現的細胞凋亡是除了壞死以外的另一種細胞的死亡形式[2]，是在外界因素的影響下導致細胞自身基因調控的啟動所發生的連鎖反應。細胞凋亡是一種由多基因調控的細胞程序性死亡，不存在炎癥反應，因此是由基因調控、凋亡因子的激活及凋亡蛋白的執行所形成的一系列反應[3]。目前研究細胞凋亡的經典途徑有死亡受體途徑、線粒體途徑及內質網途徑，其中線粒體途徑是在機體缺血缺氧、應激等狀態下引起線粒體細胞色素C的釋放，從而激活細胞凋亡的“執行者”-caspase-3(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶cysteinyl aspartate specific proteinase)的激活，繼而引發細胞凋亡的過程。caspase-3是caspase家族中的一員，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，正常情況下以無活性的caspase-3前體形式存在于細胞質中，在機體受到刺激而出現缺血缺氧時，即可立即激活caspase-3前體，從而啟動細胞的凋亡[4]，可見Caspase-3蛋白在細胞凋亡過程中具有至關重要的作用[5-6]。

先前大量實驗研究表明，心肌缺血、缺氧及再灌注損傷都可導致心肌細胞的凋亡[7]，心肌細胞的凋亡參與了多種心血管疾病，并與心肌演變、修復及預后有密切關系。AMI是各種原因引起的心肌在短時間內長期持續性缺血缺氧所引起的心肌損害，心肌的缺血缺氧首先表現在“能量工廠”-線粒體，由于線粒體內存在多種促凋亡因子及參與凋亡的蛋白，因此在機體受到外界因素的刺激時，線粒體在能量ATP下降的同時，誘導促凋亡因子的激活和釋放，從而在基因的調控下啟動并開始細胞凋亡的過程。在線粒體能量嚴重缺乏的情況下出現各種炎癥因子及鈣超載等反應，從而引起細胞的壞死[8]。在傳統觀點上，心肌梗死后出現的主要病理變化是以心肌壞死為主[9-11]，而目前大量相關研究表明，AMI時在心肌梗死部位首先出現大量的凋亡細胞，而后出現壞死[12]，這進一步說明心肌凋亡參與多種缺血性心肌病的發生發展過程。

姚玉宇等[13]通過結扎雄性大鼠冠狀動脈左前降支建立AMI模型的動物實驗研究表明，動態觀察AMI后1、7、14、28d的心肌梗死范圍及AI值，結果顯示AMI后1d細胞凋亡達高峰，隨后逐漸下降，28d左右趨于低水平狀態，這與本實驗結果基本相符。本實驗同時印證了心肌細胞凋亡過程中重要參與者-caspase-3蛋白在細胞凋亡機制中占有不可或缺的作用。

近幾年國內外大量文獻研究，關于急性心肌梗死后應用藥物干預降低心肌凋亡，進一步改善心肌重構及預后，如阿托伐他汀、辛伐他汀及芪藶強心等藥物[14-16]，不僅證實心肌細胞凋亡的存在，同時通過藥物干預組及對照組的對比后得出結論：經過應用藥物干預細胞凋亡途徑，導致心肌細胞凋亡數目減少，左室舒張末直徑及射血分數等均較前改善，保護受損心肌，降低病死率及死亡率。有關文獻顯示，通過調節凋亡因子探究細胞凋亡不同途徑，進一步證實細胞凋亡的存在及凋亡機制[17]。Luo K Q等[18]通過首先建立家兔AMI模型，應用SDF-1抗體(stromal cell-derived factor-1 )干預死亡途徑(NF-κB)，減弱心肌細胞凋亡，促進血管生成及改善心臟功能。

4 結論

本研究結果發現，在AMI后心肌梗死周邊及缺血區域有大量凋亡因子Caspase-3蛋白存在；當心肌細胞短時間內受到缺血缺氧時，可通過細胞線粒體途徑誘導細胞凋亡的啟動而出現心肌凋亡現象，進而參與AMI后心肌重構及影響心肌舒縮功能等病理變化過程。未來若應用細胞凋亡抗體則可減少細胞的不可逆性凋亡。但本研究的樣本數量較少，未來仍需大樣本研究以進一步進行認證。

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