真菌毒素暴露對組蛋白修飾影響的研究進展

李曉紅，羅紅霞，句榮輝，劉小飛，田文靜，諶小立，施鵬飛

1(北京農業職業學院，北京，102442) 2(遵義醫學院 公共衛生學院，貴州 遵義，563000) 3(北京市昌平區種子管理站，北京，102200)

霉菌毒素是由青霉菌、曲霉菌、鐮刀菌和鏈格孢菌等真菌產生的次生代謝產物[1]。它們廣泛分布于各種食物中，已經日益成為威脅人類健康的重大問題之一。其中，黃曲霉毒素(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素(OTA)、伏馬菌素B1(FB1)和T2毒素是被廣泛研究的主要污染物[2]，具有腎毒性、肝毒性、致癌性、致突變性、致畸和免疫抑制等毒性。

過去幾十年來，對真菌毒素致毒分子機制的研究主要集中在氧化應激、細胞自噬、DNA加合物的形成和關鍵基因mRNA、蛋白質的改變等方面。隨著表觀遺傳學檢測技術的發展，近年來越來越多的研究表明，真菌毒素暴露除了誘導基因序列等遺傳學改變外，還會改變基因組的表觀修飾狀態[3-7]。

已有研究表明，“表觀記憶”可作為毒物暴露前期的標志。通常環境毒物會先改變生物體的表觀基因組，表觀遺傳的改變決定了隨后的遺傳改變[8]。組蛋白的翻譯后修飾可改變 DNA 與核蛋白之間的相互作用。這些修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化。組蛋白修飾作用于多種生物學過程，如基因調控，DNA修復，染色體凝聚(有絲分裂)和精子形成(減數分裂)[9]。所以研究這些真菌毒素對組蛋白修飾的影響，將有助于解釋其致毒機制，為真菌毒素毒性的風險評估與預防提供科學的理論基礎。

1 真菌毒素對組蛋白賴氨酸甲基化的影響

組蛋白的甲基化通常發生于賴氨酸lysine (K)和精氨酸arginine(R)殘基上。組蛋白H3賴氨酸的第4、9、27、36、79位殘基(H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79)以及組蛋白H4的第20位賴氨酸殘基(H4K20)均可被甲基化。賴氨酸殘基上可發生單甲基化(me1)、二甲基化(me2)、三甲基化(me3)修飾(其中精氨酸甲基化有一甲基化, 對稱二甲基化和非對稱二甲基化 3 種修飾形式)。H3K9、H3K27和H4K20的甲基化通常集中于異染色質區域，與轉錄抑制及染色質的凝聚狀態有關；H3K4和H3K36甲基化與轉錄激活及染色質的開放結構有關[10-11]。H3K4me2在早期發育中是至關重要的調控因子，是轉錄激活的標志。已有研究表明，在H3K4me2敲除小鼠中，生殖細胞在卵子發生期間不會經歷DNA從頭甲基化[12]。H3K9me3及其甲基轉移酶參與轉錄沉默，與卵母細胞發育能力有關[13]。H3K27me3在胚胎干細胞分化過程中抑制關鍵發育基因的表達上起著重要的作用[14]。組蛋白的甲基化是由組蛋白甲基轉移酶催化完成的。可以催化H3K9發生甲基化的酶主要有：Suv39h1，Suv39h2， G9a，ESET/SETDB1和Eu-HMTase1；催化H3K4發生甲基化的酶主要為 MLL(Mixed lineage leukemia)家族蛋白，包括MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SET1A、SET1B以及ASH1；催化H3K27發生甲基化的酶為EZH2；催化H3K36發生甲基化的酶有：SET2，NSD1，SYMD2；催化的H3K79甲基化酶是DOT1。催化H4K20甲基化的酶主要有：Pr-SET7/8，SUV4-20H1和SUV4-20H2。

黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種二呋喃香豆素霉菌毒素，為I類致癌物。此毒素在自然界中含量豐富，人體不能完全通過代謝過程來解毒，并且可能蓄積在體內。食物鏈中具有強致癌性和肝毒性的AFB1的暴露是世界范圍內肝細胞癌發展的一個重要因素[15]。有研究報道，AFB1可影響表觀遺傳修飾[16]。AFB1喂養的小鼠的卵母細胞中，H3K9me3和H4K20me3(轉錄激活標記)的水平增加，而H3K27me3和H4K20me2水平(分別為轉錄抑制和激活的標記)降低。這些改變伴隨著整體基因組DNA甲基化水平的升高而發生，并與AFB1暴露的小鼠卵母細胞發育能力下降有關[17]。同樣在體外實驗中，AFB1引起豬卵母細胞H3K27me3(轉錄抑制標記)和H3K4me2(轉錄激活因子)的水平下降，而轉錄抑制標記H3K9me3的水平升高[18]。AFB1可能是通過改變組蛋白賴氨酸甲基化修飾而影響了卵母細胞的成熟。

伏馬毒素是一種由普遍存在的鐮刀菌屬霉菌產生的水溶性次級代謝產物，是玉米中常見的真菌污染物[19]。其中以伏馬毒素B1(FB1)的毒性最強，污染范圍最大，從而引起廣泛關注。FB1對動物和人類的肝臟和腎臟有致癌性。已有研究表明[20]，FB1能破壞HepG2細胞中的DNA甲基化和染色質修飾。SANCAK等[21]發現,在FB1處理的NRK-52E細胞中整體組蛋白H3K9me2/me3水平升高，H4K20me3水平降低。由此推測整體組蛋白甲基化修飾的改變可能在FB1的致癌性機制中起重要作用。

T-2毒素是由鐮刀菌(Fusarium)產生的單端孢霉烯族毒素中毒性最強、污染水平較高的A型霉菌毒素，主要污染小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥等糧食作物及麥芽、啤酒和面包等農產品[22]。T-2具有多種毒性作用，分為基因毒性、細胞毒性、免疫毒性3個方面，主要危害消化系統、神經系統、生殖系統，可造成皮膚、肝臟損傷，生產性能降低等[23]。HT-2毒素是T-2毒素的主要代謝產物。T-2毒素和HT-2毒素可通過污染飼料對動物和動物性食品消費者的健康產生危害作用。ZHANG等[7]研究表明，HT-2會阻礙豬卵母細胞成熟并且影響豬胚胎的發育。在HT-2毒素處理組中，2細胞、4細胞和囊胚期胚胎的百分比均顯著低于對照組。熒光強度分析顯示豬卵母細胞接觸HT-2毒素后，其5-methyl cyososine(5 mC)水平升高，說明HT-2毒素引起豬卵母細胞的DNA甲基化水平增高。HT-2處理組的卵母細胞中H3K4me2和H3K9me2水平升高表明組蛋白修飾也受到影響。研究結果顯示HT-2毒素通過改變卵母細胞的表觀遺傳修飾降低了豬胚胎的發育能力。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，也稱為嘔吐毒素，是分布最廣泛的單端孢霉烯毒素，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌于田間產生，并且在儲存期間可能對糧食產生二次污染[24]。它通常污染主食，如玉米、小麥、燕麥和大麥，并對人類和動物產生一系列復雜的毒性作用，例如胃腸疾病、嘔吐、腹瀉、厭食、生長障礙和免疫功能障礙[25]。也有越來越多的文獻顯示，DON可誘導促炎基因表達增加，抑制蛋白質合成并破壞線粒體功能，影響膜完整性以及細胞凋亡[26-28]。HAN等[4]以豬卵母細胞為實驗模型，研究了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇暴露誘導豬卵母細胞成熟過程中自噬/凋亡和表觀遺傳修飾的變化。研究結果表明，DON顯著抑制豬卵母細胞成熟，并通過降低p-MAPK蛋白水平破壞減數分裂的紡錘體，導致細胞周期阻滯。此外，在DON暴露下，LC3蛋白表達上調，Lamp2，LC3和mTOR mRNA水平異常，結合膜聯蛋白V-FITC染色分析結果表明DON誘導了豬卵母細胞自噬/凋亡。另外，DON通過改變DNMT3A mRNA水平增加了豬卵母細胞中的DNA甲基化水平。DON引起H3K4me2 和H3K27me3蛋白水平升高，而對H3K4me2的甲基轉移酶ASH1L的mRNA表達水平在DON處理后無顯著變化。DON引起H3K27me3的甲基轉移酶EZH2和H3K9me3的甲基轉移酶SETDB1、SUV39H2表達量上調，而對SUZ12 和 EED的mRNA表達量無顯著影響。因此，由DON引起的H3K9me3甲基轉移酶mRNA改變是其抑制卵母細胞發育能力的可能原因。

2 毒素對組蛋白精氨酸甲基化的影響

蛋白質精氨酸甲基轉移酶5(PRMT5)是主要的II型甲基轉移酶，主要通過對組蛋白的甲基化修飾來發揮作用，它能對稱性地雙甲基化組蛋白(對稱性甲基化通常在組蛋白上是一個抑制標志)，從而改變靶蛋白質的功能[29]。PRMT5調控多種關鍵的細胞途徑，具有重要的生物學作用，如細胞分化、細胞增殖和凋亡、核糖體的生物合成、高爾基體的組裝等；并與某些蛋白質包括染色體修飾酶和特異性的轉錄因子結合，導致與細胞周期調控、腫瘤細胞侵襲和轉移相關的關鍵基因轉錄抑制。另外，它在胚胎發育過程中也具有重要作用。在許多類型的癌癥和疾病(白血病、淋巴瘤、神經膠質瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌[30-34])中，PRMT5存在過度表達的現象。

GHUFRAN等[35]用一定濃度的AFB1(10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 mmol/L)分別處理人胚胎肺上皮細胞系L-132細胞12和24 h，發現PRMT5的mRNA表達量與AFB1處理呈劑量和時間依賴性。同樣，AFB1也誘導人永生化角質形成細胞系HaCaT，人肝癌細胞系HepG2和人胚腎細胞HEK293細胞中PRMT5的蛋白表達量也呈劑量依賴性升高，并且整體精氨酸甲基化水平也以類似的方式升高。該研究表明AFB1可能是通過誘導PRMT5的表達而實現對表觀遺傳過程的調控。

3 毒素對組蛋白乙酰化的影響

組蛋白的乙酰化和去乙酰化修飾與基因轉錄調控密切相關。組蛋白的乙酰化狀態主要由組蛋白乙酰化酶(histone acetylases, HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)調控。HATs可使組蛋白賴氨酸殘基乙酰化，帶正電荷的組蛋白與帶負電荷的DNA鏈的親和性降低，利于DNA構象的展開，促進轉錄因子與 DNA序列結合，從而激活基因轉錄；HDACs可使組蛋白去乙酰化，帶正電的組蛋白與帶負電的DNA 緊密結合，阻礙轉錄因子與 DNA序列結合，從而抑制基因轉錄[36]。HATs/ HDACs平衡的紊亂與腫瘤的發生密切相關[37]。

赭曲霉毒素A(OTA)是由幾種曲霉菌和青霉菌產生的一種次生代謝物[38]。OTA分布于世界各地可污染各種各樣的食物，如谷物(大麥、燕麥、黑麥、小麥、玉米)、豆類、葡萄、咖啡、可可和嬰兒食品等[39]，威脅著人類的身體健康。大量研究發現OTA暴露可以引起各種毒性效應，如肝毒性、免疫毒性、基因毒性、遺傳毒性、致癌性、致畸性、致突變性、發育毒性、睪丸毒性、胚胎毒性、神經毒性，尤其是腎毒性[40]。IARC(國際癌癥研究機構)將OTA歸為2B類致癌物。

2011年，CZAKAI等[41]研究證實，組蛋白乙酰轉移酶參與了赭曲霉毒素(OTA)致毒性和致癌性的調控。他們認為OTA導致了持續有絲分裂的停滯和無核或細胞分裂有絲分裂的退出。此外，有絲分裂染色體的異常凝聚和姐妹染色單體的分離與核心組蛋白的磷酸化和乙酰化水平的改變有關。他們觀察到組蛋白H3蘇氨酸3的去磷酸化與OTA對Haspin激酶的抑制沒有明顯的直接關系。OTA通過在有絲分裂期間對組蛋白H3蘇氨酸3的磷酸化水平的調節來調控染色體乘客復合物(CPC)在染色體上的募集。同時，OTA顯著抑制了細胞核提取物中組蛋白乙酰轉移酶(HAT)的活性，并呈濃度依賴性。HAT可以調節組蛋白和非組蛋白賴氨酸殘基的乙酰化。這些結果說明OTA可能是HAT的抑制劑。

MARIN[42]等對7 d，21 d和12個月內喂食致癌劑量OTA的雄性F344大鼠的腎臟樣品進行了分析，發現OTA增加了非典型PKC的磷酸化。這與MAPK細胞外調節激酶亞型1和2(ERK1/2)及其底物ELK1/2和p90RSK的選擇性下游激活相關。還觀察到OTA可使組蛋白去乙酰酶(HDAC)活性增強，并且HDAC活性的增強與HDAC3蛋白表達量的增加具有相關性。HDAC誘導的基因沉默先前已被證明在腫瘤發展中發揮作用。此外，PKC和MEK-ERK MAP-激酶途徑也已被證明在細胞增殖、細胞存活、抗凋亡活性和腎癌發展中起重要作用。這些發現說明OTA可能是HDAC的激活劑。但是，有關OTA致毒與組蛋白修飾之間關系的報道還很少。因此，仍需進一步從組蛋白修飾層面研究OTA的潛在毒理學作用機制。

FB1對多種動物有毒性作用。由于與神經鞘氨醇具有結構相似性，FB1通過破壞鞘脂類物質的生物合成發揮其毒性作用。在神經鞘脂類的代謝過程中，FB1競爭性地結合神經鞘氨醇N-2酰基轉移酶，從而抑制了神經鞘氨醇的生物合成，阻礙了鞘脂類的生物代謝。鞘氨醇的積累具有很高的細胞毒性可影響多種細胞系統。GARDNER等[43]研究表明，LM/Bc小鼠孕期攝入FB1會使胚胎出現腦炎，人類若在懷孕早期攝入受FB1污染的食物則會增加患神經管缺陷(NTDs)的風險。FB1抑制鞘脂生物合成中的神經酰胺合酶，引起二氫鞘氨醇(Sa)和生物活性鞘氨醇-1-磷酸(Sa1P)在血液、細胞和組織中的累積。鞘氨醇激酶(Sphk)磷酸化Sa形成Sa1P。在激活后，Sphk1主要與質膜結合，而Sphk2主要存在于核中。在過度表達Sphk2的細胞中，Sa1P在核內的積累抑制了組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)的活性，從而導致組蛋白賴氨酸殘基的乙酰化增加。在這項研究中，FB1導致LM/Bc小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中Sa1P在核提取物中的累積顯著多于細胞質提取物。核內Sa1P的增加使組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)活性降低和H2BK12，H3K9，H3K18和H3K23的組蛋白乙酰化增加。用選擇性Sphk1抑制劑PF-543或選擇性Sphk2抑制劑ABC294640處理LM/Bc MEFs會顯著減輕FB1引起的Sa1P累積(盡管Sa1P水平高于基礎水平)。并且PF-543和ABC294640的聯合處理可以阻斷由FB1引起的Sa1P在核內的積累。已知其他HDAC抑制劑會導致NTDs，所以這些結果表明誘導鞘脂代謝紊亂從而引起核內Sa1P的積累、HDAC的抑制和組蛋白的高乙酰化是FB1引起NTD的潛在機制。

研究表明[21]，FB1處理過的NRK-52E細胞中H3K9ac的整體水平降低，且高濃度FB1對H3K9組蛋白甲基轉移酶(HMT)和組蛋白乙酰轉移酶(HAT)活性有一定的影響。這說明FB1可能是通過影響組蛋白乙酰化修飾發揮毒性作用。

4 組蛋白研究方法

關于組蛋白修飾的研究方法目前最常用的為染色質免疫共沉淀技術(chromatin Immunoprecipitation，ChIP)。其基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA 復合物，然后通過超聲或酶處理將染色質打斷為一定長度范圍內的片段，然后特異性抗體免疫沉淀目標蛋白與DNA交聯的復合物，對與靶蛋白結合的 DNA片段進行富集。通過對目的片段進行純化與檢測，獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。ChIP與其他方法的結合擴大了其應用范圍。染色質免疫共沉淀結合芯片技術(CHIP-chip)是將生物芯片與ChIP相結合，在全基因組或基因組較大區域上高通量分析DNA結合位點或組蛋白修飾的方法。染色質免疫共沉淀結合新一代短序列測序技術(ChIP-seq)是將ChIP與測序技術相結合，在全基因組范圍內檢測DNA結合蛋白的結合位點和組蛋白修飾等的高通量方法，可以應用到任何基因組序列已知的物種，并能確切得到每一個片段的序列信息[44]。CHIP-chip和ChIP-seq是目前檢測組蛋白修飾最常用的方法。

另外，還有多種組蛋白修飾的檢測方法，如：多酶酶解和高分辨LTQ/Orbitrap質譜結合的組蛋白酶解肽段鑒定組蛋白翻譯后修飾(PTMs)的分布位點的方法[45]；高通量的液相色譜-串聯質譜聯用鑒定組蛋白修飾位點的方法[46]；超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜(UPLC-ESI-QTof)定量組蛋白翻譯后修飾技術[47]；高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質譜(HPLC-LTQ/Orbitrap Ms)檢測組蛋白的修飾方法[48]；免疫組織化學及蛋白免疫印跡Western Blot方法檢測組蛋白的乙酰化和甲基化水平[49]；免疫熒光染色法檢測組蛋白修飾情況[50]等。

目前，研究毒素對組蛋白修飾影響的文獻中所采用的方法有免疫熒光法測H3K27me3、H3K4me2 和H3K9me3的密度；蛋白免疫印跡法測組蛋白賴氨酸殘基的甲基化程度和組蛋白修飾酶的表達量；試劑盒吸光值法測定組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙酰化酶的活性等。但尚未有用ChIP-seq的方法研究毒素誘導的組蛋白修飾與某些特定基因表達之間關系的報道。比如體內實驗中，AFB1引起小鼠卵母細胞中H3K9me3、H4K20me3的水平增加及H3K27me3、H4K20me2水平的降低，進而導致哪些基因的表達量因組蛋白修飾的改變而改變。目前尚未有直接的證據闡明AFB1進一步的致癌機制，其他毒素在組蛋白修飾層面的研究亦存在類似的問題。因此，目前毒素在組蛋白修飾方面的發現只是其致毒調控機制的“冰山一角”，尚有很多重要問題亟待探究。

5 小結與展望

綜上所述，黃曲霉毒素(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素(OTA)、伏馬毒素(FB1)、T-2毒素、玉米赤霉烯酮(ZEA)等真菌毒素暴露會對組蛋白修飾產生影響。但在整體組蛋白修飾層面，這幾種毒素的作用機制不盡相同。AFB1可以誘導PRMT5過度表達，改變組蛋白賴氨酸甲基化修飾；DON通過影響組蛋白賴氨酸甲基化相關的甲基轉移酶的表達而改變組蛋白賴氨酸的甲基化修飾狀態；OTA可抑制組蛋白乙酰轉移酶(HAT)的活性，增強組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)的活性；FB1可抑制HDAC的活性，引起部分組蛋白的高乙酰化；T-2毒素會改變組蛋白賴氨酸的甲基化修飾狀態。

雖然各毒素的組蛋白修飾研究中，實驗模型、研究對象、暴露時間和暴露濃度及研究結果不盡相同，但這些真菌毒素對組蛋白修飾的狀態幾乎都有影響，其表觀遺傳學層面的研究無疑為探究其致毒機制提供了一個新的思路和視角。為了更全面、深入地了解這些真菌毒素在疾病的發生過程的作用和機制，目前仍需開展以下幾方面的研究：

1)進行靶位點檢測，明確毒素對組蛋白修飾的確切作用位點。目前的研究表明毒素可以干擾組蛋白修飾模式，但是其作用的特定基因靶點是什么，是否具有特異性等問題尚需探索。

2)對多種細胞系和動物進行不同劑量和時間暴露的實驗，體內與體外實驗相結合以探究毒素暴露與組蛋白修飾的關系。異常的表觀遺傳事件會引起遺傳學的改變，但是遺傳改變也會引起表觀遺傳的變化[51]。組蛋白修飾改變與基因表達變化在毒素致癌過程中是否互為因果關系需進一步明確。

3)組蛋白修飾與其他的表觀遺傳現象，即DNA甲基化、miRNA及其他非編碼RNA在毒素暴露時如何相互調控需要闡明。組蛋白修飾與DNA甲基化有關，而調控非編碼RNA表達的基因啟動子區也可能受甲基化修飾，而非編碼RNA也會靶向甲基化轉移酶及組蛋白修飾酶，需要探索這些交互作用在毒素致癌過程中的意義。

4)單細胞測序技術的出現為研究毒素在單細胞水平上的致毒機制的可變性和精確性提供了可能，會進一步推進精確毒理學概念的發展[52]。

5)組蛋白修飾是可逆的。如何運用食品功能性成分或藥物進行癌前預防或治療是一個值得探索的問題。

我們需要運用系統生物學、遺傳學、多組學、大數據分析等技術來進一步研究實驗現象和組蛋白修飾機制，對于及早預防和治療毒素暴露所引起的健康問題具有非常重要的意義。

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