基于Fem AB基因特異引物的動物雙歧桿菌PCR檢測方法的建立

溫學鵬，祁昊，郭思圻，王哲，高學軍

（東北農業大學黑龍江省高校農業生物功能基因重點實驗室，哈爾濱150030）

0　引 言

雙歧桿菌屬細菌是人與動物機體內常見的細菌之一，對改善機體內的菌群平衡、免疫能力等方面具有重要的價值[1]。

分子生物學的PCR鑒定技術如今廣泛的應用于微生物的分類與鑒別，亦可用于雙歧桿菌的鑒定[2]。雙歧桿菌屬內各個種中，常用于PCR鑒定的保守基因的相似度均很高，少數種相似度極高[3]，難以設計鑒定用特異引物，所以，尋找保守度較低一些的基因序列來設計特異引物是一個不錯的解決方法，例如SodA基因可用于好氧細菌的PCR鑒定的特異引物設計之中[4]。

本實驗分離了兩株雙歧桿菌，并以動物雙歧桿菌中編碼肽聚糖肽橋形成蛋白（Peptidoglycan bridge form ation protein）的Fem AB基因設計了特異引物行了鑒定實驗，為Fem AB基因用于PCR菌種鑒定的可行性以及動物雙歧桿菌的鑒定供了數據參考。

1　實 驗

1.1　材料

（1）實驗菌株。實驗所用雙歧桿菌菌株、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌株分離自某些益生菌藥品制劑；兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌菌株，由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室保藏。

（2）培養基。M RS培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、醋酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加蒸餾水配至1 L。固態培養基加2.0%瓊脂。

（3）儀器與試劑。PCR反應儀（T-Gradient 96 Therm oblock Modul，Biometra），凝膠成像系統等，DN A提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA，回收試劑盒等。

1.2　方法

1.2.1菌種的分離純化

采用平板劃線法對菌株進行分離。培養溫度采用37℃，培養時間為2-3 d。挑取單個菌落進行革蘭氏染色并于鏡下觀察，依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行初步鑒別。反復若干次劃線分離后取得單一形態菌落接至液態培養基，培養基變渾濁后取樣，革蘭氏染色，鏡檢，并于-80℃凍存。

1.2.2PCR模版的制備

將純化后菌接種于M RS液體培養基，37℃培養。待菌液渾濁度適合時，離心沉淀菌體并用緩沖液離心洗滌菌體2次后，使用試劑盒提取其基因組DN A。提取方法按照回收試劑盒說明書進行。所有實驗用菌株的DN A模板提取方法均一致。

1.2.3菌種的鑒定

（1）兩株雙歧桿菌的16S rDNA通用引物鑒定[5]。使用通用引物27F1492R（F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT）進行屬分類水平的PCR分析鑒定。

（2）兩株雙歧桿菌的非特異隨機引物鑒定。在NCBI數據庫中查詢相關信息，根據雙歧桿菌屬內菌種的全基因組序列情況進行分析，設計一對隨機擴增引 物（XF：CTGTCGACTATGTGGGTGTCA，XR：CCTCGGTGATGCGGATGTTC），并進行PCR擴增及片段回收測序。

PCR體系：25μL體系，DMSO 2.5μL，10×Easy-Taq Bu ffer 2.5μL，dN TP M ixture 2.0μL，模板DN A 1.0μL，引物F為1μL，引物R為1μL，EasyTaq DN A聚合酶0.25μL，滅菌蒸餾水14.75μL。

反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35次，最后72℃終延伸10 min。

（3）動物雙歧桿菌Fem AB特異引物在屬分類水平的特異性檢測。在NCBI數據庫中查詢相關信息，根據動物雙歧桿菌Fem AB基因序列進行分析，設計一對特異引物（F：GGTTCGCCAAGGACATGAC，R：GATGCCGTAGAAGTCGTACAG）。然后，先對非雙歧桿菌屬的幾種革蘭氏陽性菌DNA樣品使用相對應的種水平特異性引物[6-9]進行擴增鑒定，然后使用這幾種鑒定無誤的革蘭氏陽性菌作為陰性對照，檢驗Fem AB特異引物在屬分類水平的特異性。

PCR體系：25μL體系，DMSO 2.5μL，10×Easy-Taq Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2.0μL，模板DNA 1.0μL，引物F為1μL，引物R為1μL，EasyTaq DN A聚合酶0.25μL，滅菌蒸餾水14.75μL。

反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環25次，最后72℃終延伸10min。

（4）動物雙歧桿菌Fem AB特異引物在種分類水平的特異性檢測。使用同為雙歧桿菌屬下其他種的兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）和青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）作為陰性對照，檢驗Fem AB特異引物在種分類水平的特異性。實驗反應體系條件同（3）。

所有實驗擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，回收產物送去測序。

2　結 果

2.1　兩株雙歧桿菌屬水平的16SrDNA通用引物鑒定

使用通用引物擴增并測序所鑒定兩株菌種。結果表明兩株菌種均為雙歧桿菌屬。

2.2　兩株雙歧桿菌的非特異隨機引物鑒定

使用非特異隨機引物XF，XR對兩株雙歧桿菌進行PCR擴增。如圖1，兩株雙歧桿菌都在約100、300、800和2000bp的區域出現了四條條帶。其中約800和約2000bp區域出現的條帶經3，4泳道的條帶分析確認為單引物擴增條帶，約100區域有可能為引物二聚體，都不適合回收。

圖1　兩株雙歧桿菌非特異隨機引物擴增結果

使用回收試劑盒回收約300 bp區域的片段后進行測序，兩株雙歧桿菌所回收的兩條約300bp片段測序結果完全一致。測序結果的Blast結果如圖2所示。

圖2　兩株雙歧桿菌非特異隨機引物擴增測序部分對比結果

經NCBI的blast工具對比分析，此片段為編碼雙歧桿菌肽基脯氨酰異構酶（peptidylpro lylisomerase）基因序列的部分區域，而且此片段只能與動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）的此基因（登錄號CP009045.1）達到99%以上相似度。實驗結果可以確認這兩株雙歧桿菌均為動物雙歧桿菌。

2.3　PCR鑒定特異引物的目的基因Fem AB片段的選取與分析

革蘭氏陽性菌的細胞壁結構中，除肽聚糖主鏈以外，還有側鏈與肽橋。肽橋為革蘭氏陽性菌所特有，它作為一個交聯的中間結構使得革蘭氏陽性菌可以形成較革蘭氏陰性菌更致密的細胞壁。不同革蘭氏陽性菌的肽橋的結構成分有較大的差異[10]，這提示與肽橋相關的蛋白的基因序列可能存在有較理想的種屬特異性[11]，有成為可以鑒定革蘭氏陽性菌的PCR特異引物的目的序列的潛力。在NCBI數據庫中查找動物雙歧桿菌的肽橋合成蛋白的信息，通過其查找到相關的基因編碼信息（基因登錄號CP007755.1，354884-356167）。根據NCBI的Blast工具分析，這段序列在所有登錄在NCBI數據庫中的動物雙歧桿菌的相似度達97%～100%，而與其它雙歧桿菌屬菌種的相似度均低于75%，而與雙歧桿菌屬以外的菌種相似性則均約在35%以下（圖3）。

圖3　動物雙歧桿菌Fem AB基因的Blast工具對比的部分結果

使用DN AM AN軟件對動物雙歧桿菌與雙歧桿菌屬其它菌種的Fem AB基因序列進行對比，其對比結果顯示，動物雙歧桿菌的Fem AB基因約1300bp的序列與其他雙歧桿菌的此基因的同源性最高約75%，差異片段較分散地存在于整條序列中（圖4）。

圖4　幾種不同雙歧桿菌FemAB基因的DNAMAN工具同源性對比結果

上述幾項對比的結果顯示，動物雙歧桿菌的Fem-AB基因序列與不同屬的革蘭氏陽性菌相比有著很大的差異，與其他同屬菌的Fem AB基因相比也有較明顯的差異。依此可以推測，Fem AB基因序列有可能成為可在屬分類水平及種分類水平對動物雙歧桿菌進行鑒定的PCR特異引物的目的序列。

2.4　動物雙歧桿菌Fem AB特異引物在屬水平的特異性檢測

屎腸球菌（Enterococcus Faecium）特異引物擴增結果如圖5（a），在約100～250bp的區段可見單一明亮的特異性條；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）特異引物擴增結果如圖5（b），在約250～500bp的區段可見單一明亮的特異性條帶；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）特異引物擴增結果如圖 5（c），在約100-250bp附近的區段可見單一明亮的特異性條帶；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）特異引物擴增結果如圖5（d），在約1 000 bp附近的區段可見單一明亮的特異性條帶；兩株雙歧桿菌的特異引物擴增如圖5（e），在約500～750bp的區段可見單一明亮的特異性條帶。

圖5　枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌與動物雙歧桿菌特異引物擴增結果

圖5中，M為DL2000M aker；1為屎腸球菌菌株；2為枯草芽孢桿菌菌株；3為保加利亞乳桿菌菌株；4為嗜熱鏈球菌菌株；5為雙歧桿菌菌株1號；6為雙歧桿菌菌株2號；7為無引物空白陰性對照。

圖5中，各個圖的作為陰性對照的菌株在各自的電泳圖中在陽性菌株的特異擴增區域均無明顯與之相似擴增條帶。兩株雙歧桿菌經特異引物擴增后所回收的兩條擴增片段測序結果幾乎完全一致。測序后Blast對比結果如圖6。

圖6　動物雙歧桿菌特異引物擴增測序部分對比結果

經NCBI的blast工具對比，此片段測序結果與設計完全一致，與動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）的Fem AB基因（登錄號CP009045.1）達到99%以上相似度。結果表明，以Fem AB為模版設計的特異引物在屬分類水平上有著良好的特異性。

2.5　動物雙歧桿菌Fem AB特異引物在種水平的特異性檢測

使用動物雙歧桿菌特異引物對一株兩歧雙歧桿菌、一株短雙歧桿菌、兩株青春雙歧桿菌和本實驗所分離的兩株動物雙歧桿菌進行擴增，擴增結果如圖7，只有兩株動物雙歧桿菌泳道在約500-750bp處出現了特異擴增條帶，其他作為陰性對照的其他雙歧桿菌均未出現擴增條帶。結果表明，以Fem AB為模版設計的特異引物在種分類水平上有著較好的特異性。

圖7　利用動物雙歧桿菌Fem AB特異引物擴增不同雙歧桿菌菌種結果

3　討 論

本實驗所用的兩種市售益生菌制品的說明中寫明所用雙歧桿菌菌株分別為長型雙歧桿菌（Bifidobacteria longuMSubsp.longum）和嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacteria longuMSubsp.infantis），本實驗最初依據長型雙歧桿菌的Fem AB基因序列設計的特異引物無任何擴增片段出現。本實驗最后證明這兩株菌種并非長型雙歧桿菌的兩個亞種菌株[12]，而是均為動物雙歧桿菌。

在本研究鑒定菌種過程中借鑒了隨機擴增多態性DNA（RAPD）技術[13]。某些細菌及其近緣菌中，常用于鑒定的16SrDNA序列的相似度可能會很高，在種水平上難以對其進行區分[14]。在細菌基因組中，有著較高同源性（≥90%）的保守序列實際上并不多，而大多數序列都是有帶有一定特異性甚至是完全特異的基因序列[15]。如果使用特異性不高的引物進行近似于隨機的擴增，其擴增出帶有足夠分辨種屬的特異片段的概率實際上很高。

本研究中使用了針對動物雙歧桿菌的Fem AB這一基因序列設計特異引物，實驗結果表明，Fem AB基因在屬分類水平與種分類水平上具有足夠的特異性可作為PCR種屬鑒定特異引物設計的目的片段。本實驗使用以Fem AB為目的片段的特異引物成功建立了動物雙歧桿菌的PCR檢測方法，為包括雙歧桿菌種屬在內的其他革蘭氏陽性菌的PCR檢測方法的建立提供了新的思路與參考。

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