乳蛋白及水解物對益生菌增殖的影響

李雪霞，張娜，楊曉婉

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱，150076）

0　引 言

益生菌如嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌對健康有許多益處，越來越多地被應用到乳制品中。然而，益生菌若要獲得所期望的效果，必須達到足夠的數量和活力[1]。市場上益生菌產品的生存能力普遍較低，容易受周圍環境的影響，從而導致食品中益生菌的數量不足，嚴重影響其發揮作用[2]，同時研究發現牛乳并不是益生菌生長的最佳培養基[3-4]，因此，許多研究試圖改善牛奶及其制品的成分，以期促進益生菌增殖。

1　乳蛋白的主要組分及對益生菌增殖的效果

乳蛋白主要為酪蛋白和乳清蛋白兩大類，具有含量豐富，分布廣泛等特點。大量研究證實酪蛋白，乳清蛋白及二者的水解物均能促進益生菌增殖。

1.1　酪蛋白及其水解物對益生菌增殖作用

酪蛋白是乳中的含磷蛋白質，約為牛乳中總蛋白含量的80%[5]，自1953年，Gyorgy首次發現母乳促進雙歧桿菌生長后，研究人員開始進一步研究和闡明母乳中的雙歧桿菌促生長因子[6，7]。Azum a以質量濃度為10 g/L的κ-酪蛋白為原料，證實母乳κ-酪蛋白可作為嬰兒雙歧桿菌SI2（一株自母乳喂養的嬰兒糞便中分離的菌株）促進生長因子，但用凝乳酶或胃蛋白酶水解后促生長效果更好[8]。Prou lx發現，最適于促進雙歧桿菌生長的商業酪蛋白水解物中含有99.6%分子量小于2 000 u的小肽[9]，并在1994年發現通過A lcalase，糜蛋白酶或胰蛋白酶水解酪蛋白酸鈉獲得的多肽（M P）、氨基酸和小肽級分（AA）的分子質量分布，其中A lcalase水解的小于2 000 u的M P和AA含量最高分別為98.46%和99.02%[10]。同樣，St-Gelais發現添加相對分子質量分布小于2000 u的酪蛋白水解物于培養基中能顯著促進乳酸球菌W g2生長[11]。

酪蛋白水解物對不同的益生菌增殖的效果也不同，在2006年Zhang以酪蛋白為原料利用堿性蛋白酶在不同水解度條件下得到水解產物，以嗜酸乳桿菌的菌數作為考察指標，未水解的酪蛋白為對照，發現水解度為10.1%的水解產物對嗜酸乳桿菌的促進效果最為明顯，為對照組的1.2倍[12]。同時，趙紅宇對酪蛋白、乳清蛋白、乳清蛋白水解物和大豆水解物的促進益生菌增殖效果進行了比較，發現添加1%酪蛋白水解物對雙歧桿菌Pba增殖效果最顯著，與空白相比提高超過1 mL-1（對數值），同時發現嗜酸乳桿菌Ac，雙歧桿菌In f'的生長（P＜0.05）也可以顯著促進，其中雙歧桿菌In f'增長近1個對數周期，而對于保加利亞乳桿菌3和嗜熱鏈球菌9的生長基本沒有影響，對數值僅為0.02 mL-1[13]；不同來源的水解物增殖效果不同，如與牛乳來源的酪蛋白糖巨肽（Casein glycopeptides，CGM P）相比，母乳來源的CGM P對雙歧桿菌的增殖效果是牛乳來源CGM P的4倍[8]；酶的種類也會影響到增殖效果，如湯茜分別將牛乳κ-酪蛋白的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶酶解產物以及CGM P在體外培養24 h后都對雙歧桿菌BBM N 68具有增殖效果，其中，增殖作用最強的是堿性蛋白酶水解產物，活菌數達到109mL-1[14]；酪蛋白水解物對益生菌具有促進作用的同時，也表現出對有害菌的不同程度的抑制效果，在連續給予小鼠喂食CGM P 15 d后，乳桿菌、腸桿菌科以及雙歧桿菌數量顯著增加（P＜0.01），大腸菌群顯著減少（P＜0.05），而腸球菌沒有顯著變化[15]。

1.2　乳清蛋白及其酶解物對益生菌增殖作用

Janer等人用實驗證明，從牛奶或從山羊和綿羊奶中共同提取的乳清蛋白的濃縮物（w hey protein concentrate，W PC），可以促進牛奶中乳酸雙歧桿菌的生長。在牛奶中加入2%W PC培養24 h，活菌數可達109cfu/mL[16]。

1.2.1α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

從牛奶分離出來的α-乳白蛋白在氨基酸比例和結構，以及功能特性上與母乳都非常相似，這使α-乳白蛋白在“母乳化”嬰兒配方食品中得到廣泛應用[17]。Bury發現補充α-lactalbumin或β-lactoglobu lin可以達到同樣添加量的W PC相同效果的63%，并發現促進乳酸菌生長的組分是熱穩定的，在加熱到121℃持續5 min并沒有失去促進生長效果，提出促進乳酸菌生長的組分可能是a-核苷酸，非蛋白氮，或者一些細菌蛋白胨中所沒有的特定熱穩定肽[18]。Petschow和Talbot也提出除了α-乳白蛋白之外，β-乳球蛋白也是較好的促進益生菌生長的因子[19]。2007年，M iralles還證實糖基化的β-乳球蛋白對大腸桿菌具有殺菌作用[19-20]。

1.2.2乳鐵蛋白

母乳喂養的嬰兒與配方奶粉喂養的嬰兒相比較體內的雙歧桿菌和乳桿菌數要多，這是乳鐵蛋白與母乳其他因子共同作用的結果[21]。雙歧桿菌是乳鐵蛋白耐性細菌，據報道乳鐵蛋白促進雙歧桿菌在體外和體內實驗中的生長。Kim等在存在和不存在乳鐵蛋白的情況下培養24 h后測試四種雙歧桿菌菌株的生長，結果顯示相對于沒有添加乳鐵蛋白的培養物，通過660 nm處的OD值測量發現全脂乳鐵蛋白對短雙歧桿菌，嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌具有適度的生長促進作用，但對長雙歧桿菌無促進作用[22]。Yam auchi通過給予嬰兒喂食包含牛乳鐵蛋白嬰兒配方奶粉，經體外實驗發現乳鐵蛋白促進短雙歧桿菌JCM 1192數量增加約20%[23]。H u以新生豬為對象研究含重組人乳鐵蛋白轉基因牛奶對腸道菌群的調節效果，從腸道樣本的細菌計數結果發現喂食富含乳鐵蛋白乳粉的豬結腸中的雙歧桿菌和腸道乳酸菌的數量分別為8.74和10.11 log cfu/g，比普通乳粉分別增加0.08和0.61 log cfu/g[24]。

表1　乳清蛋白和酪蛋白及其水解物對益生菌增殖研究概況

1.2.3乳清蛋白水解物（W PH）

國外學者發現一些益生菌在添加W PH的脫脂乳培養基中顯著增長[25]。Cham pagne研究比較了保加利亞乳桿菌在乳清蛋白、W PH和牛乳中的生長狀況，發現W PH的促生長效果優于乳清蛋白[26]。白鳳翎的研究同樣發現乳培養基中添加乳清蛋白水解物對乳酸菌生長的促進作用，其中對嗜熱鏈球菌作用高于保加利亞乳桿菌近1.5 log cfu/mL。以W PH作為添加物，同時以乳清蛋白和乳清蛋白酸水解物作為參照物進行嗜酸乳桿菌B增殖實驗，從600 nm處OD值可以看出，在37℃培養12 h后，與對照組相比，嗜酸乳桿菌B培養12 h的OD值平均比對照組高0.119，差異顯著，說明在培養基中添加W PH會對嗜酸乳桿菌具有顯著的增殖效果[27]。韋慧娟研究乳清蛋白水解物對干酪乳桿菌增殖實驗，發現乳清蛋白水解物替代量為30%時干酪乳桿菌促生長作用最強，在分別培養4 h和12 h活菌數分別高達7.41和8.58 log cfu/mL，同時OD值也驗證了這一變化趨勢，分別為0.5和4.0左右[28]。

乳清蛋白和酪蛋白及其水解物對益生菌增殖研究概況整理如表1所示。

2　益生菌增殖作用研究所應用的技術

常用分析測定益生菌的技術有實時聚合酶鏈式反應和熒光原位雜交（FISH）技術，用于確定細菌菌數的方法還有重量法，吸光度（即比濁法）和活菌計數法。

2.1　實時聚合酶鏈式反應

實時聚合酶鏈式反應（real-tim e po lym erase chain reaction，R eal-tim e PCR）是一種定量測定樣品中特定DN A序列的聚合酶鏈反應。即使用標記（最常用是熒光標記）的PCR引物，因而能夠通過熒光監測到每一次PCR循環后擴增所得DN A產物的量，從連續監控下獲得的反應動力學曲線，可推導得樣品中被擴增模板DN A的原初含量。R eal-tim e PCR被廣泛應用到乳蛋白促益生菌增殖作用的研究中。M artín在研究母乳含有雙歧桿菌以及他們是否可以通過母乳喂養傳播給嬰兒的腸道的研究中應用real-tim e PCR測定母乳中雙歧桿菌的數量[29]。江巖也采用了real-tim e PCR，分析不同劑量的乳源CGM P對小鼠腸道雙歧桿菌增殖水平的影響[30]。而 Mullié使用 PCR檢測法檢測了雙歧桿菌對21個健康用牛奶喂養的嬰兒的糞便中的雙歧桿菌進行研究[31]。田梅將real-time PCR法與常規細菌鑒定法進行了比較。研究通過對4662例腹瀉患者的糞便標本同時進行real-time PCR法與常規細菌鑒定法檢測，對其結果進行統計學分析，發現兩種方法無統計學差異（P＞0.05），對real-time PCR檢測陽性標本進行常規細菌鑒定法檢測，陽性率為100%。研究證實real-time PCR法檢測沙門菌與志賀菌結果可靠，檢測時間短，更能滿足臨床診斷腸道疾病的需求[32]。

2.2　熒光原位雜交（FISH）技術

FISH是以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子結合，雜交后再通過免疫細胞化連接上熒光染料。FISH具有敏感、快速、能同時顯示多種顏色等優點，不但能顯示于中期分裂相中，還能顯示于同期核中。Bruck使用熒光原位雜交技術研究可能促 進由雙歧桿菌主導的胃腸道微生物的生長的牛乳[33]。Sm ehilová應用此項技術比較了母乳喂養的過敏性結腸炎嬰兒和健康嬰兒的糞便菌群，應用FISH對雙歧桿菌、大腸桿菌和酪酸梭菌活菌進行定量檢測得出健康嬰兒腸道內雙歧桿菌數量最多，通過雙歧桿菌選擇性培養基培養的健康嬰兒雙歧桿菌細菌計數的對數值為（9.87±0.76）g-1，FISH程序檢測到的雙歧桿菌為9.94±0.46 log cfu/g。在過敏性結腸炎雙歧桿菌嬰兒檢測雙歧桿菌計數的對數值為（8.12±0.88）g-1，FISH檢測的對數值為（8.27±0.32）g-1，兩種方法檢測結果無顯著的差異[34]。FISH也被用于探討CGM P對小鼠糞便微生物群的影響，FISH被證明是一個快速和相對低成本的檢測方法，可用于進一步的理解人類腸道微生物[35]。

2.3　其他方法

除上述用來研究益生菌增殖的方法，還有一些用來測定益生菌菌數的方法，如重量法，吸光度（比濁法）和活菌計數法。其中，重量法作為經典的分析方法準確度高，但是重量分析法操作繁瑣，耗時長，難以滿足控制分析的需要，且在微生物操作中無菌操作困難，容易感染雜菌。該法一般不用于分析菌液濃度的變化。佟曉芳在一種益生菌發酵米乳的制備方法中就應用到了重量法[36]。吸光度（即比濁法）測菌液濃度來比較細菌生長情況在益生菌增菌中應用較多，該法操作簡單，精確度高。張英春采用比濁法測定潛在益生菌生長曲線，從而研究益生菌促進人體健康和防止疾病中發揮作用[35]。張強在測定三株益生菌發酵特性中也應用了比濁法[37]。此外，最常用的活菌計數法即平板計數法，還有厭氧滾管計數法等[38]。培養基培養技術對此課題的研究是十分重要的，微生物培養基的酸堿度、凝膠強度和選擇性等直接影響到培養基的質量。

3　結束語

隨著經濟的發展以及人們日益增長的對健康的強烈追求和渴望，益生菌及其制品成為研究的熱點，被廣泛地用于醫學、食品、生物等領域，在食品領域，益生菌產品尤其是益生菌乳制品的開發越來越得到人們的重視，成為益生菌研究的主流方向。但乳蛋白對益生菌增殖作用的機制仍不明了，進一步研究和闡述乳蛋白對益生菌增殖作用的機制將進一步解決人們腸道健康問題。乳蛋白對益生菌增殖作用的研究報道還不夠全面，基于益生菌對于人類健康的益處，進行相關研究更具有深遠的意義，也將成為未來的發展趨勢。

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