乳粉中蕈狀芽孢桿菌的萌發條件優化

朱毓華，趙允，毛勇，戴絢麗，曾志明，秦丹

（娃哈哈集團有限公司質量監控部，杭州310018）

0　引 言

近年來，芽孢菌已成為乳粉的微生物污染研究中備受關注的對象[1-2]。乳粉芽孢菌因其優良的耐熱性能，往往為乳原料熱殺菌帶來較高風險。而芽孢萌發后，其抗熱性能會大大降低，從而大大降低乳粉原料熱殺菌風險。

芽孢萌發開始吸收水分、鹽類和其他營養物質而體積增大、折光率下降、染色性增強，釋放DPA，耐熱性消失，酶活性和呼吸力提高[3]。近年研究發現有多重因素可以刺激芽孢萌發?，F今已發現萌發條件主要有pH值、萌發劑[4]、高壓[4]、溫度預處理[6]、化學物質[7]等。芽孢利用一種或幾種小分子物質迅速萌發，如氨基酸、糖類或嘌呤核苷，稱為營養萌發（nutrient germination），而這些小分子物質稱為營養萌發劑（germinant）[8]。

本研究選擇由乳粉原料中分離的蕈狀芽孢桿菌為代表性的菌株，以芽孢的萌發率為調查指標，研究了不同條件對蕈狀桿菌芽孢萌發的影響,為產品生產和原料預處理提供了方法支持。

1　實 驗

1.1　材料

（1）菌株：實驗用蕈狀芽孢桿菌（Bacillusmycoides）菌株為實驗室自行分離，經純培養后API鑒定為蕈狀芽孢桿菌，經實驗室保存命名為NC-1。

（2）產芽孢培養基。

（3）萌發緩沖液：pH值為 6.0，濃度為 7.0，8.0 mm o l/L磷酸鹽緩沖液。

（4）萌發劑：鑒于L-丙氨酸經常被選為枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌萌發劑，故選用L-丙酸作為萌發劑進行條件的摸索。

1.2　儀器與設備

超凈工作臺，高壓滅菌鍋，生化培養箱，漩渦震蕩儀，顯微鏡，紫外分光光度計。

1.3　方法

1.3.1芽孢制備

將菌株接種于LB培養基中，溫度30℃，轉速200 r/min活化過夜，將活化后的菌液1%接種于CCY培養基，30℃，轉速200 r/min培養60 h，鏡檢至體系中孢子率大于99%為止；離心（12 000 r/min，10 min）收集孢子，用滅菌水室溫洗滌和離心10次；最后用萌發緩沖液懸浮芽孢至OD 600nm≈1.0（近似4.0×108mL-1）。放置于4℃保存，每周用緩沖液洗滌1次[9]。

1.3.2芽孢萌發的檢測

由于芽孢開始萌發后，體系在600 nm的光密度隨著萌發率的增大而降低（芽孢折光性高，而萌發后吸光性強），并且在此范圍內光密度的減小量與芽孢萌發率成反比。故可通過測量芽孢體系在600 nm的光密度降低率可以計算芽孢的萌發率[10]。

1.3.3不同pH值芽孢的生長曲線

在250 mL三角瓶中裝入30 mL LB液體培養基，分別調節其pH值至6.0、7.0、8.0，滅菌后以10 mL/L接種量接種，溫度36℃（240 r/min）振蕩培養。每小時測定OD 600 nm光密度值，并涂片觀察萌發情況。

1.3.4不同濃度L-丙氨酸刺激單因素實驗

制備原濃度為200 mm o l/L和1 000 mm o l/L的

L-丙氨酸溶液，并按照1∶1比例與芽孢萌發液中進行混合，使L-丙氨酸溶液終濃度為100 mm o l/L和500 mm o l/L，每10 min檢測芽孢萌發率。

1.3.5不同溫度預處理單因素實驗

用50，60，70℃和80℃四種不同溫度處理芽孢萌發液，在熱刺激15 min后首次測定萌發率，熱激完成后轉至36℃（240 r/min）振蕩培養30 min，測定最終OD 600 nm值。

1.3.6不同溫度熱刺激及不同濃度L-丙氨酸雙因素實驗

使用pH值7.0磷酸鹽緩沖液，分別配制濃度為0，50，100，200，500 mm o l/L的 L-丙氨酸溶液，過濾除菌，接種一定濃度芽孢孢子記錄初始的OD 600 nm值，每種濃度下L-丙氨酸溶液孢子懸液需經不同溫度熱激，分別為50，60，70℃和80℃。熱激15 min后測定OD 600 nm值，熱激完成后轉至36℃（240 r/min）振蕩培養30 min，測定最終OD 600 nm值。

2　結 果

（1）不同pH值條件蕈狀芽孢桿菌萌發刺激結果如圖1所示；不同濃度L-丙氨酸中蕈狀芽孢桿菌NC-1萌發刺激率如圖2所示。

圖1　不同pH值條件蕈狀芽孢桿菌NC-1萌發刺激

圖2　不同濃度L-丙氨酸條件下蕈狀芽孢桿菌NC-1萌發率

在萌發溫度37℃，使用pH值為6.0，7.0，8.0的緩沖液，萌發劑為L-丙氨酸（濃度50 mm o l/L）混合物的固定條件下，蕈狀芽孢桿菌NC-1芽孢在pH值7.0的緩沖液中萌發速度最快（圖1）；芽孢在pH值為6.0和pH值為8.0開始萌發的時間至少推遲近兩小時（圖2）?？梢?，蕈狀芽孢桿菌芽孢在中性環境中可以迅速萌發。

由圖2可以看出，以L-丙氨酸作為萌發劑條件下，濃度500 mm o l/L的L-丙氨酸可使芽孢在60 min內達到80.20%，而濃度為100 mm ol/L的L-丙氨酸僅在60 min內達到41.40%，較高濃度處理得到較大萌發率。（2）熱激對蕈狀芽孢桿菌NC-1的萌發刺激

單純熱刺激的萌發情況如表1所示。由表1可以看出，熱刺激可以促使芽孢萌發，在熱刺激單因素作用下，50～80℃范圍內，溫度越高所得萌發率越高。

表1　單純熱刺激下蕈狀芽孢桿菌萌發率 %

熱刺激+L-丙氨酸雙因素實驗結果如表2所示。由表2可以看出，50～80℃熱刺激15 min為最優溫度條件；50～500 mm o l/L L-丙氨酸濃度范圍內，L-丙氨酸濃度的越高，萌發率越高。能夠達到＞90%萌發率的處理需至少添加100 mm o l/L L-丙氨酸，并接受80℃熱刺激15 min后，保溫30min。實驗發現最優萌發條件應為80℃熱刺激15 min且500 mm o l/L L-丙氨酸，其僅在熱激15 min后，即可達到萌發率94.41%，36℃搖床30 min后更可達到接近100%的萌發率。

表2　50 mmol/L L-丙氨酸和100 mmol/L L-丙氨酸的萌發率 %

表3　200 mmol/L L-丙氨酸和500mmol/L L-丙氨酸的萌發率 %

3　結 論

乳飲料或乳制品產品的乳粉原料中普遍存在芽孢桿菌，其難以被殺滅，而其萌發后抗性大大降低，給食品滅菌、食品風味的保持、延長食品保藏期等帶來好處。研究在乳飲料或生產配制過程中更高效使芽孢萌發從而被輕易地殺滅的條件，以及運用多種誘導芽孢萌發因素的組合是一個重要的思路。蘇云金芽孢桿菌可單獨利用L-丙氨酸或肌苷萌發[11]，而炭疽芽孢桿菌不能單獨利用肌苷萌發[12]，蠟樣芽孢甚至于在37℃100 mmol/L L-丙氨酸條件下，15 min即可使95%以上的的芽孢萌發為繁殖體[13]。對于蕈狀芽孢桿菌，目前國內外報道主要集中于分類研究，對于其萌發營養途徑的研究比較空白。本文以乳粉中分離的蕈狀芽孢桿菌為代表，研究了蕈狀芽孢桿菌的萌發最優萌發條件應為80℃熱刺激15 min且500 mm o l/L L-丙氨酸，36℃搖床30 min后更可達到接近100%的萌發率。這些數據的積累為生產實踐中的工藝方法調整做好基礎。

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