唾液乳桿菌Ls04對小鼠腸道菌群及黏膜SIgA質量濃度的影響

郝薇，范彧，閆雪，解林奇，劉媛媛，王安如

(北京大北農科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室，北京100192)

0　引言

唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）主要來源于人和動物的口腔及腸道，是一種具有多種生理功能的重要益生菌。研究表明，唾液乳桿菌能夠影響腸道菌群結構，幫助建立以有益菌為主體的腸道微生物菌群[1]；對先天性免疫防御系統及免疫機能具有調節作用，提高小腸局部黏膜免疫水平[2-4]；還可產生有機酸、過氧化氫，分泌多種細菌素[5-8]，防止單細胞增生李斯特菌、幽門螺旋桿菌等致病菌的感染[9-12]。唾液乳桿菌Ls04能夠在胃腸道模擬環境中保持高存活率，對腸道致病菌具有良好的體外抑制作用，具有潛在的益生性能[13]。本文對Ls04對小鼠腸道微生物區系及腸黏膜分泌型免疫球蛋白A（secretory imm unoglobulin A，SIgA）質量濃度的影響及持續作用效果進行研究，以期能夠更加全面的評估唾液乳桿菌Ls04的益生特性。

1　實驗

1.1　材料

菌株：唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）菌株Ls04由北京大北農科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室保存；E.coli K 88（C 83901）、E.coli K 99（C 83709）購自中國獸醫藥品監察所。

試驗動物：SPF級昆明白、雄性、3周齡小鼠100只，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司，小鼠每籠5只飼養于普通籠中，籠底墊上碎木屑并每3天更換；控制室內溫度20℃～25℃、濕度45%～50%，12 h黑暗，12 h光照；日常用水采用純凈水，滅菌，基礎日糧為SPF級標準小鼠生長維持期顆粒飼料，自由采食飲水。

培養基及試劑：BBL瓊脂培養基用于雙歧桿菌（Bifidobacterium）計數；M RS瓊脂培養基用于乳桿菌（Lactobacillus）計數；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（Violet red bile glucose，VRBG）用于腸桿菌（Enterobacteriaceae）計數；Pfizer瓊脂培養基用于腸球菌（Enterococcus）計數；胰月示亞硫酸鹽環絲氨酸瓊脂培養基（T ryptose sulfite cycloserine，TSC）用于產氣莢膜梭菌（C lostridium perfringens，C.perfringens）計數；營養肉湯瓊脂培養基（N utrient Broth，NB）用于大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）K88、K99培養；小鼠SIgA Elisa（enzym e linked imm unosorbent assay）試劑盒用于小鼠腸黏膜SIgA含量的測定。

1.2　方法

1.2.1菌株活化及抑菌實驗

將冷凍干燥的唾液乳桿菌Ls04菌粉（實驗室制備，活菌數為8.4×1010cfu/g）接種于M RS肉湯培養基中，37℃靜置培養24 h，經傳代培養，以1%接種量接種于MRS培養基中，過夜培養后，5 000 r/min離心10 min，取上清液用于抑菌試驗；將營養肉湯瓊脂培養基（含1%葡萄糖）高壓高溫滅菌后，冷卻至45℃，按1μL菌液/mL培養基的比例加入過夜培養的E.coli K 88、K 99菌液，震蕩混勻，倒入無菌平板，凝固待用。在瓊脂平板等距放置3只牛津杯，每只牛津杯中加入100μL待測唾液乳桿菌菌液（3個重復），37℃培養20 h，卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.2實驗動物處理

小鼠購進后，適應性喂養7 d，隨機分成4組，每組25只，即Ls高、中、低劑量組及對照組。實驗設計與分組如表1所示。各組灌胃量均為0.2 mL/只，灌胃時間15 d。

表1　實驗設計與分組

2　結果

1.2.3小鼠大腸黏膜采集及菌群測定

將灌胃前及灌胃15 d各處理組小鼠，及灌胃結束后第3，7，14天的Ls中劑量組小鼠斷頸處死，每組5只，解剖后剖開大腸，無菌操作刮取大腸黏膜組織約0.1 g，將其溶于10 mL無菌生理鹽水中，充分溶解后進行稀釋，選3個稀釋度進行平板計數，每個稀釋度3個平行。用于大腸桿菌計數的VRBG平板于30℃培養，24 h后觀察結果；用于乳桿菌計數的MRS平板以及用于雙歧桿菌計數的BBL平板置于厭氧罐中，37℃培養48 h后計數；腸球菌于Pfizer平板計數，35℃厭氧培養48 h；產氣莢膜梭菌用TSC平板分離，涂布完成后倒置于厭氧罐中，36℃培養20 h后計數[14]。

1.2.4小鼠小腸黏膜采集及SIgA測定

無菌取上述處理組小鼠小腸部分2.5 cm，去除腸道內殘渣后，刮取小腸黏膜表面，加入無菌pH=7.2濃度為0.01m ol/L的PBS緩沖溶液200μL，充分震蕩混勻，于40℃，轉速為4 000 r/min離心15 min，收集上清液，-80℃凍存待測。采用酶聯免疫方法（ELISA）中的雙抗體夾心法測定樣品中SIgA水平[15]，按SIgA試劑盒說明書進行檢測。

1.2.5統計分析

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，結合Ducan法進行多重比較，結果以平均值±標準差表示。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2.1　唾液乳桿菌Ls04抑菌特性

E.coli K 88、K 99被認為是引起腹瀉的主要致病菌。由表2可以看出，唾液乳桿菌Ls04的菌液在E.coli K 88和K 99平板上均表現出清晰的透明抑菌圈，表明該菌對E.coli K 88和K99具有顯著的抑菌特性。

表2　唾液乳桿菌菌液抑菌圈直徑（n=3）

2.2　不同劑量的唾液乳桿菌Ls04對小鼠腸道菌群的影響

灌胃前后各處理組小鼠腸道菌群結構如表3所示。由表3可以看出，對照組小鼠經15 d灌胃后，腸球菌數量顯著升高（P＜0.05），乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌數量相較于灌胃前均無顯著差異（P＞0.05）。Ls低、中、高劑量組小鼠腸道中乳酸菌數量隨灌胃劑量的增加而顯著升高（P＜0.05）。雙歧桿菌數量同樣顯著升高，Ls低、中、高劑量組之間差異不顯著，但Ls中劑量組中雙歧桿菌數量最高，達4.2×107cfu/g左右。灌胃唾液乳桿菌Ls04后，腸球菌、腸桿菌及產氣莢膜梭菌均被顯著抑制。Ls低劑量組小鼠腸道中腸桿菌、腸球菌及產氣莢膜梭菌數量與對照組無顯著差異（P＞0.05），Ls04中劑量、高劑量的添加則顯著降低了小鼠腸道中上述各菌數量（P＜0.05）。Ls中劑量組中腸桿菌、腸球菌及產氣莢膜梭菌數量分別約為7.8×104，1.7×107g-1及3.3×104g-1，顯著低于對照組而與Ls高劑量組無顯著差異。由此可見，Ls04中劑量的添加即可有效增加小鼠腸道中有益菌數量，并最大程度抑制腸桿菌等腸道致病菌。

2.3　不同劑量的唾液乳桿菌對小鼠腸道黏膜SIgA質量濃度的影響

灌胃唾液乳桿菌Ls04對小鼠腸黏膜SIgA質量濃度同樣具有顯著影響（P＜0.05）。如圖1所示，Ls低劑量組小鼠腸黏膜SIgA質量濃度約為15.8μg/mL，與對照組無顯著差異。Ls中、高劑量組與對照組相比，小鼠腸黏膜SIgA質量濃度均顯著升高，并且Ls中劑量組小鼠腸黏膜SIgA質量濃度最高，約為19.1μg/mL。

圖1 灌胃唾液乳桿菌Ls04對小鼠腸黏膜SIgA質量濃度的影響（n=5）

圖1中，柱狀圖上所標字母相異表示差異顯著（P＜0.05），所標字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

2.4　唾液乳桿菌的定植對小鼠腸道菌群的影響

為進一步研究唾液乳桿菌Ls04的定植對小鼠腸道菌群結構影響的持續作用，在Ls中劑量組小鼠灌胃結束后14 d內，研究其腸道菌群結構的動態變化過程。如表4所示，灌胃結束后，Ls中劑量組小鼠腸道中乳桿菌及雙歧桿菌數量分別約為2.4×108g-1和4.2×107g-1，結束后3 d，腸道中乳桿菌、雙歧桿菌數量有所降低，隨后保持相對穩定。至灌胃結束后14 d，小鼠腸道中乳桿菌、雙歧桿菌數量分別為1.3×108g-1和3.0×107g-1，仍顯著高于灌胃前水平（P＜0.05）。灌胃中劑量Ls04使小鼠腸道中腸桿菌數量顯著降低，至灌胃結束后14 d，腸桿菌數量雖顯著升高至約2.1×105g-1，相較于灌胃前仍被顯著抑制（P＜0.05）。產氣莢膜梭菌數量在灌胃結束后顯著升高，至14 d其數量基本恢復至灌胃前數量水平（P＜0.05）。而小鼠腸道中腸球菌數量在灌胃結束后并無明顯變化（P＞0.05）。

2.5　唾液乳桿菌的定植對小鼠腸道黏膜SIgA質量濃度的影響

為研究唾液乳桿菌Ls04的定植對小鼠腸黏膜SI-gA質量濃度的影響，本研究對Ls中劑量組小鼠在灌胃前及灌胃結束后14 d內小鼠腸黏膜SIgA質量濃度的動態變化進行了測定。如圖2所示，灌胃中劑量Ls04后，小鼠小腸黏膜SIgA質量濃度顯著升高。在灌胃結束7d內，小鼠腸黏膜SIgA質量濃度顯著降低，隨后保持相對穩定，至灌胃結束后14 d，腸黏膜SIgA質量濃度約為16.1μg/mL，顯著高于灌胃前水平（P＜0.05）。

圖2中，柱狀圖上所標字母相異表示差異顯著（P＜0.05），所標字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

圖2　Ls04中劑量組小鼠灌胃前及灌胃后小腸黏膜SIgA的動態變化（n=5）

表3　灌胃唾液乳桿菌對各組小鼠腸道菌群的影響（n=5） g-1

表4　灌胃結束后唾液乳桿菌Ls04中劑量組小鼠大腸黏膜處微生物區系的動態變化（n=5） g-1

3　結果與討論

唾液乳桿菌Ls04滿足潛在益生菌的篩選標準，且對E.coli K 88、E.coli K99具有顯著的抑菌特性，這與之前報道相一致[16-18]。除大腸桿菌外，唾液乳桿菌由于其高效產酸性能及其所產細菌素的廣譜抑菌特性[6,9]，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌均具有顯著的體外抑制作用[19]。

微生物菌劑進入到機體腸道后，需要在腸黏膜表面黏附定植、形成生物屏障并分泌抑菌物質，才能有效抑制病原菌，發揮平衡腸道微生物區系的益生作用。Tannock等[20]曾報道，唾液乳桿菌是為數不多的能夠在宿主腸道內有效定植甚至在腸道乳酸菌中占數量優勢的菌種。本文結果顯示，Ls中劑量組小鼠在灌胃結束14 d乳酸菌數量保持相對穩定且高于灌胃前水平，這一點間接說明了唾液乳桿菌Ls04的腸道定植力。本文結果同樣顯示，灌胃Ls04能夠顯著提高小鼠腸道內雙歧桿菌的數量，而這一結果在仔豬動物試驗上得到了證實：飼喂仔豬唾液乳桿菌B1后，B1能夠有效地定植于仔豬腸道內，并且增加哺乳前期仔豬糞便和十二指腸局部黏膜雙歧桿菌的相對豐富度[21]。

益生菌的作用機制不僅包括平衡胃腸道微生物環境，還能對腸道免疫系統進行有效的刺激和調節[22-23]。SIgA是機體腸黏膜免疫系統重要的抗體之一，由SIgA參與的體液免疫是防御病原菌在腸黏膜定植的重要防線。因此，本文對Ls04對小鼠腸黏膜SIgA質量濃度的影響及持續作用效果進行了研究。結果表明，唾液乳桿菌Ls04能夠在腸道內有效定植并促進腸黏膜SIgA的分泌。張錦華（2011）曾報道了唾液乳桿菌B1對新生仔豬免疫性能的影響，結果表明，飼喂唾液乳桿菌B1后，仔豬小腸、特別是十二指腸處IgA分泌細胞數量相較于對照組顯著升高，差異極顯著[21]，這與本文結果基本一致。此外，有報道稱腸道內的一些共生菌同樣能夠誘導SIgA的分泌[24]。Moreau和Baforiau-Routhiau研究發現，雙歧桿菌、特別是在嬰兒腸道中的雙歧桿菌，與促進SIgA的合成分泌以及提高抗感染病原菌的能力密切相關[25]。

本文結果提示，唾液乳桿菌Ls04在停止服用后仍能夠有效抑制小鼠腸道致病菌，增殖有益菌；并且能夠持續有效地提高小鼠腸黏膜SIgA質量濃度，刺激機體免疫反應。因此將唾液乳桿菌Ls04應用到益生菌產品中去，可持續平衡腸道菌群、增強機體免疫力，具有廣闊的市場應用前景。

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