副干酪乳酸桿菌所產抑菌物質的特性研究

佳木泰，林曉龍，吳敬，郭海燕，芒來,道楞

（內蒙古農業大學a.動物科學學院；b.食品科學學院，呼和浩特010018）

0　引言

通過近些年研究，干酪乳桿菌劃分出新種，即副干酪乳桿菌（L.paracasei）。L.paracasei耐酸、N aC l及膽汁鹽，并具抗過敏作用[1]。其被劃分為干酪乳桿菌菌群[2]。

乳酸菌產的乳酸、乙酸、CO2、H2O2、細菌素等具有抑菌活性[3-4]。J Lozo報道L.paracasei BGBUK 2-16能產生具有抑菌作用的細菌素[5]。M.Atanassova也提出L.paracasei subsp M 3可產抑制細菌、真菌的物質，鑒定為類細菌素[6]。高瑩等得出L.paracasei HD 1.7對B.subtilis的作用方式為抑菌[7]。滕志利提出L.plantarumA8對Escherichia coli的作用方式為殺菌[8]。Caridi A等人發現Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei BGBUK 2-16所產抑菌物質可低溫儲存[9]。因此L.paracasei所產細菌素有望成為食品防腐劑。

本研究篩選分離自內蒙古傳統乳制品中的乳酸桿菌，得到副干酪乳桿菌Q-1-4，并對其進行生理生化和分子生物學鑒定，確定所產抗菌物質的性質，為開發具有新型生物防腐劑功能的細菌，細菌素奠定了基礎。

1　實驗

1.1　菌株

由內蒙古牧區家庭以傳統發酵法制作的酸馬奶樣品中分離了本實驗所需的8株乳酸菌。不同類型的指示菌—革蘭氏陰性菌4株、革蘭氏陽性菌7株。以上菌株均由內蒙古農業大學食品科學與工程學院食品生物技術團隊提供。

1.2　培養基

以參考文獻[10-11]備注的培養基配制方法為參考。

1.3　試劑

過氧化氫酶(2 000～5 000 U/mg)購于美國Sigm a公司；胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶(250 U/mg)購于北京Amersco公司；木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）、蛋白酶K(40 m Ansom U/mg)；細菌基因組DNA提取試劑盒；其他化學試劑：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、氯仿；吐溫 20、吐溫 80、Tx-100、SDS、EDTA、尿素；硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鋇、氯化鈣均為國產分析純。

1.4　儀器

HPS-250生化培養箱；PB-10 pH計；BCN-1360型生物超凈工作臺；CP1502C電子天平；PCR儀；RE-52CS-1旋轉蒸發儀；KDC-140HR高速冷凍離心機。

1.5　方法

1.5.1乳酸菌的活化以及無細胞上清液的制備

將半固體穿刺保藏好的試驗菌株接種于5 mL的M RS液體培養基中，放置培養箱里37℃培養24 h，按2%的接種量活菌傳3代，將最后一代液體培養物在離心機中以轉速為6 000 r／min的速率離心15 min（4℃）后，用旋轉蒸發儀將上清液濃縮10倍，0.45μm孔徑的濾菌器過濾除菌，得到CFS，置于4℃保存備用[13]。

1.5.2指示菌菌懸液的制備

將保存的指示菌挑單菌落接入LB液體培養基中，37℃培養24 h后，以2%的接種量再活化2代，第3代培養24 h后。用0.85%無菌生理鹽水梯度稀釋至菌懸液濃度為106mL-1，4℃保存待用。

1.5.3抑菌活性的測定

采用雙層瓊脂平板擴散法檢測待檢菌中是否具有抑菌活性[14]，采用雙層瓊脂平板擴散法，以枯草芽孢桿菌（B.subtilis CGMCC 1（B）63501）為指示菌進行抑菌實驗。

1.5.4產抑菌活性物質的乳酸菌篩選

1.5.5產抑菌物質乳酸菌的鑒定

采用常規的形態學、生理生化鑒定及16S rRNA序列分析進行種屬的鑒定。

（1）菌體形態和生理生化鑒定。將半固體保存的試驗菌株接種到MRS液體培養基中，傳兩代。在固體培養基上劃線37℃培養48 h后，觀察菌落形態及菌體形態。

通過形態觀察，對篩選出的乳酸菌菌株做常規的生理生化試驗：過氧化氫酶試驗、葡萄糖產氣試驗、發育溫度試驗（15℃、45℃生長）和糖發酵試驗等。根據《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》[15]和《常見細菌系作用的乳酸菌基因組總DNA，并以此DNA為模板，利用細菌rDNA引物進行PCR擴增[17]，用于擴增的引物為一對通用引物，正向引物為27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′，反向引物為1495r：5′，-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR的反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，58℃復性1 min，72℃延伸2 min，30次循環，最后72℃延伸5 min。將PCR產物回收后進行測序。將獲取的序列結果與GenBank數據庫中的相關種屬的序列進行比對，利用DNAStar軟件構建其系統發育樹，并進行系統發育樹分析。

1.5.6L.paracasei Q-1-4產抑菌物質的確定

（1）酸及酸性末端產物作用的排除。為排除酸性末端產物的干擾，將濃縮10倍的無細胞發酵上清液pH調至5.0和5.5，采用調配成相同pH值的乳酸和乙酸為對照，進行抑菌試驗。

（2）過氧化氫的檢測與排除。由濃度為50 mm o l/L的磷酸緩沖液（pH=7.0）溶解過氧化氫酶配成母液，按終質量濃度為1 mg/mL加入到排酸后的CFS中，37℃溫浴2 h取出后在水浴箱100℃煮沸5 min使酶滅活，再調至排酸pH后進行抑菌試驗。

（3）蛋白酶對抑菌物質活性的影響。將各酶溶解在pH=7.0的磷酸緩沖液中配成母液(胃蛋白酶溶解在pH 2.0的磷酸緩沖液中)，將5份等量的CFS的pH調至胰蛋白酶、蛋白酶K、溶菌酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的最適pH(依次為7.6，7.0，6.5，2.0，6.2)，按終質量濃度1.0 mg/mL加入各酶液，37℃溫浴2 h后100℃水浴5 min使酶滅活[18]。將pH值調至排酸pH值，以未經酶處理CFS為對照，進行抑菌實驗。

1.6　L.paracasei Q-1-4的抑菌動力學曲線

將待測菌株接種于裝有MRS液體培養基的試管中37℃恒溫培養，每間隔2 h在600 nm波長下測光密度值，共測。以時間為橫坐標，光密度值為縱坐標，得到乳酸菌的生長曲線[19]，同時以B.subtilis CGM CC 1（B）63501做指示菌，采用雙層瓊脂平板擴散法，測定不同培養時間菌株無細胞上清液的抑菌活性。

1.7　L.paracasei Q-1-4所產抑菌物質的特性

1.7.1抑菌物質的pH穩定性

分別用濃度為1 m o l/L的HC l和1 m o l/L的NaOH將該菌的CFS pH值調為2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0；以調配成相同pH值的MRS液體培養基為對照，進行抑菌實驗。

1.7.2抑菌物質在不同pH值下的熱穩定性

將調至不同pH值的無細胞發酵上清液分別于60，80，105，121℃下處理30min，冰浴急冷后，將未經溫度處理的CFS為對照，進行抑菌實驗。

1.7.3抑菌物質的紫外線敏感性

取等量的CFS，并將其平鋪于滅菌平皿中，輸出調至40 W的紫外燈下距離40 cm分別輻照10，30，統鑒定手冊》[16]中描述的特征進行分析，確定其菌株歸屬。

（2）分子生物學鑒定。提取所純化的具有抑菌120 min，將未經紫外處理的CFS為對照[13]，進行抑菌實驗。

1.7.4有機溶劑對抑菌物質的影響

將甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丁醇加入到CFS中，使終質量分數為1.0%。將未經有機溶劑處理的CFS與加入相同有機溶劑濃度處理的M RS液體培養基為對照[20]，進行抑菌試驗。

1.7.5表面活性劑對抑菌物質的影響

將Tw een 20、Tw een 80、Tx-100、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素(U rea)加入到CFS中，使終濃度為1.0%。將未經表面活性劑處理的CFS和加入相同表面活性劑濃度處理的M RS液體培養基為對照[21]，進行抑菌實驗。

1.7.6金屬離子對抑菌物質的影響

將溶解在濃度為50 mm o l/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）中的不同金屬離子（包括FeSO4，ZnSO4，Cu-SO4，BaC l2，CaC l2，mgSO4）溶液分別按 1:1的體積與CFS混合。將未經金屬離子處理但加入相同體積超純水的CFS和加入相同金屬離子濃度處理的M RS液體培養基為對照[22]，進行抑菌實驗。

1.7.7抑菌物質保藏的穩定性

將代謝產物分別在常溫，4℃和-20℃下儲藏0，20，40，60 d；檢測不同溫度及不同時間的儲藏對指示菌抑菌活性的變化[23]。

1.7.8L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質的抑菌譜

將各類革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌活化傳3代，第3代的培養菌數進行梯度稀釋調至106mL-1，進行抑菌實驗。

1.8　數據處理

每個試驗三個平行，數據用平均值±標準偏差（SD）表示，用軟件SPASS 19.0進行數據分析。

2　結果與討論

2.1　產抑菌活性物質乳酸菌的篩選

將使用雙層瓊脂平板擴散法，以革蘭氏陽性菌B.subtilisCGMCC 1（B）63501為指示菌，對內蒙古牧區家庭傳統手工工藝制作的酸馬奶中的8株乳酸桿菌進行抑菌活性菌株篩選，結果見表1。

表1　乳酸菌的抑菌活性

由表1可以看出，8株乳酸桿菌均對指示菌有抑制作用。從中選取抑菌效果較好的Q-1-4進行后續研究。

2.2　產抑菌物質乳酸菌的鑒定

2.2.1菌體形態和生理生化鑒定

將菌株分離純化后，在MRS固體培養基上37℃培養24 h之后的菌落特征見圖1。光學顯微鏡下菌體形態由圖2所示。菌株Q-1-4生理生化鑒定結果如表2所示，呈短桿狀，成對或成鏈狀排列，革蘭氏染色呈陽性，無芽孢。表中這些生理生化特征與文獻[24]中描述得L.paracasei的特征相同，初步鑒定歸入副干酪乳桿菌。在公布的乳桿菌屬和種的分類中，德國微生物與細胞培養物保藏中心將副干酪乳桿菌直接劃分為干酪乳桿菌菌群[2]。由于副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌以及干酪乳桿菌中的其它亞種具有很高的相似性，需要結合分子生物學試驗對其進行鑒定。

菌落特征如圖1所示；光學顯微鏡下菌體形態如圖2所示；生理生化鑒定結果如表2所示。

表2　菌株Q-1-4的生理生化特征

圖1　乳酸菌Q-1-4的菌落形態特征

圖2　乳酸菌Q-1-4的菌體形態（10×100）

2.2.2分子生物學學鑒定

以菌株Q-1-4的DNA為模板，采用16S rDNA引物進行PCR擴增，獲得長度為1500 bp的16SrDNA堿基序列。將其與GenBank中已知菌株的基因序列進行同源性比較，結果見表3，系統發育樹見圖3。

表3　菌株Q-1-4的同源性分析

圖3　菌株Q-1-4的系統發育樹

由表2和圖3可以看出，實驗菌株和已知菌的親緣關系，菌株Q-1-4與L.paracasei同源性高達99.2%，在進化樹中處于同一分支，故判定Q-1-4為L.paracasei。將生理生化試驗和分子生物學試驗相結合，認定菌株Q-1-4為L.paracasei。

2.3　 L.paracasei Q-1-4產抑菌物質的確定

2.3.1酸與過氧化氫作用的排除

由于乳酸菌在代謝中產生的過氧化氫和酸性末端產物也可抑制細菌的生長，故應排除過氧化氫和酸的干擾，結果如表4所示。

表4　酸與過氧化氫作用的排除

由表4可以看出，pH 5.0的乳酸、乙酸對B.subtilisCGMCC1（B）63501沒有抑制作用，而 pH 5.0的L.paracaseiQ-1-4產生的CFS對其有明顯的抑制作用，說明CFS的抑菌活性不是由有機酸引起的，仍然存在其他的抑菌物質。

經過氧化氫酶處理后的L.paracaseiQ-1-4發酵上清液抑菌能力比未處理的CFS低，但還存在較強的抑菌作用，從而說明乳酸菌發酵上清液中的過氧化氫不是主要的抑菌物質，還存在其它的物質抑制指示菌。

2.3.2蛋白酶對抑菌物質活性的影響

為了確定抑菌物質的性質，用蛋白酶K、溶菌酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理CFS，測定酶處理前后對指示菌B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑菌活性變化，結果如表5所示。

表5　蛋白酶對抑菌物質活性的影響

由表5可以看出，L.paracaseiQ-1-4經胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理之后對指示菌B.subtilisCGMCC1（B）63501的抑菌活性顯著下降，但仍然具有較強的抑菌作用，而經過溶菌酶處理之后抑菌活性沒有變化，說明該抗菌物質中含有蛋白類物質或肽類物質。仍具有抑菌活性的原因可能是菌株Q-1-4所產抑菌物質不僅僅含有蛋白類物質，還有胞外多糖等其他具有抑菌效果的代謝產物。，具體成分有待進一步分析確定[18]。經胰蛋白酶和胃蛋白酶處理之后抑菌活性下降最大，說明L.paracaseiQ-1-4對胰蛋白酶和胃蛋白酶最敏感，而在人體腸道內又存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，所以在人體內可被消化吸收而無殘留，可作為安全放心的食品防腐劑得以應用。

2.4　 L.paracasei Q-1-4的抑菌動力學曲線

圖4　 L.paracasei Q-1-4生長曲線及抑菌活性

目前，細菌素產量和抑菌活性強弱通常是通過抑菌圈的直徑進行衡量[25-26]。將L.paracaseiQ-1-4 37℃培養60 h，每隔2 h測定OD 600nm、pH值及CFS對B.subtilisCGM CC 1（B）63501抑菌活性，結果見圖4。

由圖4可以看出，L.paracaseiQ-1-4培養至4 h即進入對數期，12～14 h后進入到穩定期，從整個發酵過程中可以看出，L.paracaseiQ-1-4產酸能力較強，最終pH值穩定在3.9左右。L.paracaseiQ-1-4從對數期前期（6 h）開始，就有了抑菌活性，進入穩定期(12 h)后抑菌物質產量持續增加，穩定期后期(22 h)的抑菌物活性達到最高水平。故選取發酵22 h的發酵液作為后續研究對象。

2.5　 L.paracasei Q-1-4所產抑菌物質的特性

2.5.1pH穩定性

將L.paracaseiQ-1-4產生的CFS的pH值調至2.0～6.0，進行抑菌試驗，結果如表7所示。

表7　抑菌物質的pH穩定性 mm

由表7可以看出，L.paracaseiQ-1-4產生的抑菌物質在pH 2.0～5.0時對B.subtilisCGMCC1（B）63501有抑制作用，抑菌活性隨pH升高而逐漸降低。當pH＞5.0時，對B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑制作用消失。因此，抑菌物質對B.subtilisCGMCC1（B）63501的有效抑菌pH范圍為pH 2.0～5.0。該抑菌物質在強酸條件下抑菌活性較強，這是由于乳酸菌素在低pH值時，乳酸菌對其吸附能力低，這種吸附作用隨著pH值降低而增強，因此，該抑菌物質在低pH值時具有較高的抑菌活性，在高pH值時無抑菌活性[27]，所以它適用于偏酸性食品中。

2.5.2熱穩定性

將不同pH的CFS分別在60，80，105，121℃下處理30 min，將未經溫度處理的CFS作為對照，進行抑菌實驗，結果如表8所示。

表8　抑菌物質的熱穩定性

由表8可以看出，L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質在同一處理溫度，不同pH下，隨著pH的升高，抑菌能力逐漸下降，當pH值為2.0時各溫度環境下得抑菌圈直徑平均為38.44 mm,pH值為5.0時各溫度環境下抑菌圈直徑減小至平均18.01 mm，平均下降20.43 mm。不同溫度環境下的抑菌環直徑隨pH值升高而縮小的規律相近，且縮小幅度隨pH值升高而增加，pH值達到5時抑菌能力明顯下降。這可能是由于高pH環境使細菌素的蛋白質結構構象發生了變化[27]，從而導致抑菌活性下降。L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質在同一pH值不同處理溫度下，隨著處理溫度的升高，抑菌活性逐漸降低。但總體來說，降幅不大，各pH值條件下平均下降僅1.65 mm。該抑菌物質對高溫表現出了相對良好的耐受性。耐高溫是該抑菌物質的有利優點，食品加工高溫處理時，其抑菌活性不受影響，故在食品加工中可得到廣泛的應用。

2.5.3抑菌物質的紫外線敏感性

將L.paracaseiQ-1-4的CFS在40W的紫外燈下將距離40 cm分別輻照不同時間的抑菌物質活性如表9所示。

表9　抑菌物質對紫外線的敏感性

由表9可以看出，經紫外線輻照不同時間的抑菌物質的抑菌活性與對照組無顯著差異，說明，L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質對紫外線不敏感。由于有些食品防腐劑不耐高溫高壓殺菌，便可以通過紫外殺菌的方式來達到滅菌的目的。該抑菌物質對紫外有耐受性，故在食品防腐劑領域有著巨大的應用潛力。

2.5.4有機溶劑對抑菌物質的影響

L.paracaseiQ-1-4的CFS用甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿處理后進行抑菌試驗，結果如表10所示。

由表10可以看出，上述有機溶劑對抑菌物質的抑菌活性沒有明顯影響，說明該抑菌物質對有機溶劑具有良好的耐受性。

2.5.5表面活性劑對抑菌物質的影響

L.paracaseiQ-1-4的CFS分別用質量體積濃度為 1%的Tween 20、Tween 80、Tx-100、EDTA、SDS、Urea處理后進行抑菌實驗，結果如表11所示。

由表11可以看出，經 Tween 20、Tween 80、Tx-100、U rea處理的CFS對抑菌物質的抑菌活性沒有明顯影響。添加SDS的抑菌物質對B.subtilisCGM CC 1（B）63501的抑制作用明顯增強。這可能是由于SDS作為陰離子表面活性劑，通過與蛋白天然結構中的內部疏水區的配位作用使得蛋白結構被打開，從而影響蛋白質的立體結構[28]。L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質與EDTA共同作用效果好于單一作用。對于革蘭氏陰性菌，EDTA起到外膜滲透劑的作用，絡合掉脂多糖維持其結構所需的鈣離子，破壞其結構；對革蘭氏陽性菌的抑制作用則主要是由于EDTA與金屬離子結合[29]。

表10　有機溶劑對抑菌物質的影響

表11　表面活性劑對抑菌物質的影響

2.5.6金屬離子對抑菌物質的影響

將L.paracaseiQ-1-4的CFS與溶解在50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）不同金屬離子（包括FeSO4，ZnSO4，CuSO4，mgSO4，BaC l2，CaC l2）溶液分別按 1:1體積混合。以未經金屬離子處理的CFS及相同金屬離子濃度處理的M RS液體培養基為對照，進行抑菌實驗，結果如表12所示。

表12　金屬離子對抑菌物質的影響

由表12可以看出，上述金屬離子對抑菌物質的抑菌活性沒有明顯影響（P＞0.05），說明對上述金屬離子有一定的耐受性。

2.6　抑菌物質保藏的穩定性

代謝產物在不同溫度下儲藏不同時間后對指示菌抑菌活性的變化結果表13。

由表13可以看出L.paracaseiQ-1-4在常溫、4℃、-20℃儲藏20 d后的CFS對B.subtilisCGMCC 1（B）63501的抑菌活性基本沒有明顯的變化。

表13　抑菌活性在儲藏過程中的變化

由表13可以看出，40 d后，抑菌活性略微降低一點，基本保持穩定。60 d后，其活性均不同程度的降低，其中-20℃的損失最小，具體機理還有待于進一步研究。可見L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質在儲藏過程中對冷凍和冷藏有較好的耐受性，所以其在食品保藏方面具有一定的應用潛力。

2.7　 L.paracasei Q-1-4所產抑菌物質的抑菌譜

通過以不同的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌做指示菌，進行抑菌試驗，得到L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質的抑菌譜，結果如表14所示。

表14　Q-1-4所產抑菌物質的抑菌譜

由表14可以得出，L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質對所選的指示菌均顯示了較強的抑菌活性，其中對S.aureusCM CC（B）26112、E.coliATCC 25922、S.typhim uriumCMCC 50115、B.subtilisCGM CC 1（B）63501等顯示了很強的抑菌活性，抑菌圈直徑16 mm以上；對B.cerecusCGMCC1.1686、G.stearotherm ophilusGM CC 1.1923等顯示了較強的抑菌活性，抑菌圈直徑13 mm以上。由此可知，L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質抑菌譜較廣，對包括食品腐敗菌和致病菌在內的許多革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，這使得該抑菌物質有著廣闊的開發潛力。目前作為防腐劑應用于食品中的N isin也只抑制革蘭氏陽性細菌，1999:214-222.對革蘭氏陰性細菌、酵母菌抑制效果不好[30]。可見，由L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質在應用前景上比N isin更廣闊。

3　結論

通過采用雙層瓊脂平板擴散法，從分離自內蒙古牧區手工乳制品的8株乳酸桿菌中篩選出抑菌效果較好的一菌株為Q-1-3，并通過分子學鑒定認定該菌株為L.paracasei。將L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質經排酸、排過氧化氫后對B.subtilisCGM CC（B）63501仍具有明顯的抑制作用，但經過不同蛋白酶處理后，抑菌活性在不同程度上有所下降，抑菌物質中含有蛋白類物質。L.paracaseiQ-1-4對指示菌的抑制作用來自其代謝產物，且在培養至6 h時開始具有抑菌活性，22 h左右達到最高。所產生的抑菌物質對B.subtilisCGM CC（B）63501作用方式是抑菌而非殺菌，抑菌譜較廣。L.paracaseiQ-1-4所產抑菌物質在pH 2.0～5.0范圍內對B.subtilisCGMCC（B）63501有抑制作用。在此pH范圍內抑菌物質對熱有耐受性，對紫外不敏感，耐儲藏，有機溶劑、金屬離子、表面活性劑對其影響不顯著，但與SDS和EDTA共同作用效果好于單一作用，且對指示菌的作用方式為抑制其生長。

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