基于miRNA-10b調控宮頸癌LncRNA-H19網絡通路機制的研究

滕彥玲， 牟曉梅

(1.吉林市中心醫院 檢驗科，吉林 吉林 132011；2.北華大學附屬醫院 檢驗科)

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的第三大惡性腫瘤。在宮頸癌的發病機制中某些特定基因的異常表達或過表達可能是引起腫瘤細胞增殖的重要原因[1]。H19的表達與宮頸癌的發生密切相關[2]，可抑制宮頸癌細胞增殖[3]，而二者是否存在相互作用、作用機制未知。本研究從信號通路HOXA1為切入點，結合RNA干擾和miRNA芯片技術，篩選所有可能受到HOXA1轉錄調控的miRNA分子，通過分析并證實miRNA-10b分子可直接負反饋調控HOXA1，研究LncRNA-H19調控的miRNA-10b家族分子對宮頸癌細胞生長、凋亡的影響，構建一個相對完整的LncRNA-H19、miRNA-10b與靶基因HOXA1信號途徑相互作用的調控網絡，從而為進一步解釋宮頸癌的發生發展提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1細胞培養

選取人源性宮頸癌細胞系HeLa進行研究(由中國科學院上海生命科學院細胞庫提供)。將細胞加入到含10%牛血清蛋白DMEM-F12 (1∶1)培養基中，在37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁生長后用胰蛋白酶處理、傳代，取對數期生長細胞以1.0×105的密度接種到六孔板上，備用。

1.2細胞轉染

把H19 cDNA(GeneBank accession no.NR_002196.1)構建到pDNA3.1載體(購自美國Invitrogen公司)的多克隆位點上。特異性的H19 siRNA或其陰性對照(H19：4390771，life technologies carlsbad，CA)轉染到HeLa細胞中，從而來敲除H19的表達。將宮頸癌細胞按照2×105/孔種植在24孔平板上培養24 h，利用脂質體2000(購自美國Invitrogen公司)將0.5 μg的pDNA-H19或pcDNA-mut-H19轉染到兩種宮頸癌細胞中，繼續培養48小時。

1.3CCK-8檢測細胞生長狀況

取HeLa的48孔板，以2×105/孔的密度種植在24孔平板上培養24 h，用脂質體2000將0.5 μg的pDNA-H19與miRNA-10b類似物miR-10b mimics(購自上海吉瑪制藥技術有限公司)一同轉染到宮頸癌細胞中，將其分別作為第一、第二組、第三組共同轉染pDNA-H19和miRNA-10 inhibitor(對照組)，繼續培養48小時棄去孔內培養基，加入 CCK-8 溶液 10 μl/孔，置入培養箱中37℃，5%CO2條件下孵育分別經24、48、72小時取出，用酶標儀檢測一次，酶標儀波長設定為 450 nm。

1.4實時定量PCR

分別對HeLa細胞做如下處理，miR-10b mimics轉染，pDNA-H19和miR-10b mimics共同轉染，pcDNA-mut-H19和miR-10b mimics共同轉染。取對數生長期的處理后細胞接種到 6 孔板中，接種密度為 2×105個/mL，培養24小時后，用 TRNzol 試劑提取總 RNA，用 M-MLV 逆轉錄。定量PCR所使用H19引物、miR-10b引物化及U6引物(內參對照)均購自生命科技公司，其完成引物的合成與測序。H19上游擴增引物：5′-AGCGGGTCTGTTTCTTTACTT-3’,下游擴增引物：5′-AGCTGGGTAGCACCATTTC-3′；miRNA-10b 上游引物5′-CGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3′ 下游引物5′-CGCCGCCCAGTGTTCAGA-3′，利用生命科技公司(Carlsbad，CA)的Fast Start Universal SYB Green Master(ROX)系統測定H19和miRNA-10b的表達水平，采用相對定量法比較、分析結果，每個實驗重復三次。

1.5Westernblot檢測蛋白表達水平

將以上三種處理后的細胞提取總蛋白后，BCA法測IGF1R蛋白濃度。配制10%分離膠行SDS-PAGS電泳，轉膜后依次加入一抗、二抗孵育。以GAPDH為內參將膠片掃描，凝膠圖像處理系統分析目的條帶光密度值及分子量，進行統計分析。

1.6統計方法

2 結果

2.1H19可抑制miRNA-10b的表達

用RT-PCR檢測miRNA-10b的表達水平，結果顯示，與pcDNA-mut-H19和miRNA-10b共轉染組比較，pDNA-H19和miR-10b 共轉染組的miR-10b表達量下降(P<0.05)，與pDNA-H19和miR-10b inhibitor共轉染組比較，miR-10b表達量差異沒有統計學差異(P>0.05),說明H19 抑制miRNA-10b的表達，見圖1。

向過表達H19的HeLa細胞轉染miRNA-10b或miRNA-10 inhibitor共轉染組細胞增長明顯高于pcDNA-mut-H19和miRNA-10b共轉染組(P<0.05)

圖1H19可抑制miRNA-10b的表達

2.2H19促進IGF1R表達

用Western blot檢測IGF1R蛋白表達量顯示，pDNA-H19和miR-10b 共轉染組的IGF1R蛋白量增加(P<0.05)，與pDNA-H19和miR-10b inhibitor共轉染組比較IGF1R蛋白量沒有統計學差異(P>0.05),由此可以說明H19促進IGF1R表達，見圖2。

3 討論

MicroRNAs (miRNAs)被作為一類分子標記物，在近年來的腫瘤研究中占有重要地位。長度為21-23個核苷酸的miRNA片段，可作為非編碼miRNA通過與特定的mRNA的3'UTRs區域結合使之降解或抑制其翻譯，從而發揮基因調節作用。

pDNA-H19和miR-10b 共轉染組的IGF1R蛋白表達量高于pcDNA-mut-H19和miR-10b 共轉染組(P<0.05),與pDNA-H19和miR-10b inhibitor共轉染組比較IGF1R蛋白量沒有統計學差異(P>0.05)

圖2H19促進IGF1R表達

miRNAs可參與細胞的多種生理和病理過程，在細胞增殖、凋亡、遷移，糖和脂質代謝，免疫應答中均可發揮重要作用[4]。有研究報道，miRNA-10b在宮頸癌細胞中的表達量明顯降低，借助基因工程在宮頸癌細胞中過度表達miRNA-10b能夠抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移，且通過調節IGF1R可發揮抑制miRNA-10b表達的作用[5]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類在基因表達的各個層次環節發揮基因調節功能的RNA分子，由200 個核苷酸組成，其作用主要從表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控等方面實現。其中 lnc RNA-H19 是目前長鏈非編碼RNA中唯一由印跡基因編碼，其基因表達水平隨著胚胎發育而降低。多項研究顯示H19在宮頸癌組織中有印記缺失現象(Loss of Imprinting，LOI)，提示 H19 LOI 和宮頸癌的發生有著高度相關性[6]。

近年來，眾多研究者對腫瘤的研究重點放在長鏈非編碼 RNA上。 H19 是一類早期發現由印記基因編碼的在胚胎期高度表達的長鏈非編碼 RNA，其表達水平隨著個體發育成熟而逐步降低。科學家通過研究闡明，啟動子區域的高甲基化是 H19 在成熟機體低表達的重要原因[7]。雖然H19與腫瘤的關系還不能明確，但在多種腫瘤的發生、發展過程中其具有促癌或抑癌的作用。有研究顯示，H19可在胃癌組織中高表達，并通過與p53 作用促進細胞增殖[8]。但也有研究報道 H19 和 miR-675 間存在共同作用通路，在前列腺癌的發展過程中通過抑制 TGFBI 的翻譯可抑制前列腺癌的遷移[9]。我們的研究發現，在宮頸癌癌細胞中 H19過表達時，miRNA-10b的表達水平降低，同時可引起腫瘤細胞生長速度加快。說明miRNA-10b能夠抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，是與宮頸癌密切相關的分子。 H19 抑制 miRNA-10b表達的這一現象將為此類研究提供線索，為通過調節H19基因序列來治療宮頸癌提供依據。

[1]鐘 茜，趙 霞.宮頸癌診治中的過度治療與治療不足[J]．中國計劃生育和婦產科雜志，2013，5(2):21.

[2]王文玲.印跡基因H19在宮頸癌中的表達及意義[D].蘭州大學,2007.

[3]祝敏捷，孫蓮芳，楊 靜.血清 miR-21 和 miR-10b 在早期宮頸癌患者中的表達及臨床意義[J].現代中西醫結合雜志,2017,26(11):1167.

[4]何 燁,王科明.長鏈非編碼RNA在腫瘤中作用的研究及進展[J].現代腫瘤醫學,2013,(6):1381.

[5]Hou R,Wang D,Lu J.MicroRNA-10b inhibits proliferation,migration and invasion in cervical cancer cells via direct targeting of insulin-like growth factor-1 receptor[J].Oncology Letters， 2017，13(6):5009.

[6]邱劍萍.宮頸癌中H19基因的特異表達模式及印記缺失分析 [J].中國現代醫藥雜志,2008,(11):31.

[7]彭 艷,謝海棠,孫 紅,等.人長鏈非編碼RNA基因H19克隆、表達載體構建及對MCF7細胞增殖的影響[J].中國藥理學通報,2015,16(4):555.

[8]Hao Li,Beiqin Yu,Jianfang Li,et al.Overexpression of lnc RNA H19 enhances carcinogenesis and metastasis of gastric cancer[J].Oncotarget.2014,5(8):2318.

[9]Miaojun Zhu,Qin Chen,Xin Liu,et al.lncRNAH19/mi R-675 axis represses prostate cancer metastasis by targeting TGFBI[J].FEBS J,2014,281(16):3766.