人食道癌細胞Ecap-109耐藥細胞的建立及意義

趙 鑫,常 穎,劉玉俠,趙 暉,盧衛平,王啟文*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所)

食道癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其中90%的食道癌是食道鱗癌。目前的主要治療手段為手術治療及化療。但是，在化療治療過程中，很多人會對化療藥物產生耐藥，影響治療效果。為了探求腫瘤細胞的耐藥機制及為腫瘤耐藥治療提供實驗模型，我們用順鉑反復誘導的方法建立了人食道癌細胞Ecap-109耐藥細胞模型，為進一步研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1試劑及器材IMDM培養基，Gibco產品；MTT(噻唑藍)，Sigma產品；胎牛血清，天津TB公司；DMSO(二甲基亞砜)，Sigma產品；順鉑，購于江蘇豪森藥業股份有限公司；瓊脂糖，DNA標準品，寶泰克公司產品；低溫低速離心機，SORVALL RTT USA；全自動酶標儀，Labsystems Dragon；萬能視頻成像系統(LY-WN-HPCCD)，成都勵揚精密機電有限公司；電泳儀,上海天能。

1.2食道癌細胞系Ecap-109吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.3方法

1.3.1培養人食道癌細胞Ecap-109 將Ecap-109細胞從液氮罐中取出復蘇后，離心洗滌，加入含10%FCS的IMDM培養液的培養瓶中，置于CO2培養箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養。

1.3.2誘導Ecap-109細胞耐藥 將Ecap-109細胞培養至指數生長期且已鋪滿瓶底80%以上時，加入終濃度為50 μmol/L順鉑，培養1小時后棄去含順鉑培養基，更換為新鮮配制的含10%FCS的IMDM培養液，置于CO2培養箱中繼續培養，每天觀察細胞生長狀態，拍照。待細胞長滿培養瓶時，用0.25%胰酶消化傳代。待再長滿瓶底時用同樣濃度同樣方法沖擊，再培養并觀察細胞生長狀態，拍照，再傳代。如此反復，體外連續培養、沖擊、傳代，并反復凍存，復蘇，觀察細胞株生長穩定性，同時進行抗藥性檢測。

1.3.3檢測細胞抗藥性 用MTT法，將培養的人食道癌細胞株Ecap-109和經過順鉑沖擊處理4次和6次的Ecap-109細胞培養至對數生長期，用0.25%胰酶消化，生理鹽水洗滌，計數后，重懸于10%FCS的IMDM培養液，調整細胞密度為5×104/mL，加入96孔培養板，100 μL/well，置于CO2培養箱中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養過夜，細胞貼壁后加入順鉑，終濃度分別是100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同時設陰性對照(等體積的生理鹽水)和空白對照(無細胞)。各組設6復孔。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜止培養72小時，培養結束前4小時加入MTT(5 mg/mL)，20 μL/well，繼續培養，培養結束后，小心吸棄培養上清，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩溶解后，用全自動酶標儀檢測各孔吸光度值(A) ，波長為492 nm。

計算方法：抑制率=[1-(實驗組均值/陰性對照組均值)]×100%。

50%細胞生長抑制所需的藥物濃度(IC50)：應用SPSS17.0軟件計算IC50值。

耐藥指數(RI)=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.3.4檢測耐藥Ecap-109細胞多藥耐藥基因(MDR)表達 提取人食道癌細胞Ecap-109細胞及順鉑耐藥細胞DNA，用PCR擴增法做MDR1全長序列(約4.7kb)檢測。引物設計：上游引物 ATGGATCTTGAAGGGGACCGCAATGGAGG，下游引物 CATCTCATACAGTCAGAGTTCACTGGCGC。擴增方法和條件： 在離心管內加入下列物質：10x bf ，2.5 μl；MgCl2，2.5 μl；DNTP(2 mM)，1.0 μl；Primers ，1.0 μl (each)；DDW，16.0 μl；Target，1.0 μl；95℃,5 min；Tag ，0.5 μl；94℃，60 s；55℃，80 s；72℃，150 s；共30個循環,72℃延伸10分鐘。用0.8%的瓊脂糖進行凝膠電泳。

1.4統計學方法應用SPSS17.0統計學軟件進行分析，計量數據采用Mean±SD表示，使用t檢驗進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1細胞生長狀態及生長特征

細胞在接受50 μmol/L cDDP沖擊后，出現大量死亡細胞，活細胞數銳減，直至剩下很少的單個細胞。之后經過長期培養，慢慢出現單細胞克隆(見圖1，圖2)。待單細胞克隆長到一定程度后進行消化、傳代，繼續培養，恢復單層排列(圖3，圖4)。待細胞長滿后，再次用同樣劑量沖擊此細胞，如此反復，共沖擊6次。對沖擊4次和6次的Ecap-109分別進行耐藥檢測和多藥耐藥(MDR)基因檢測。

我們分別檢測了經50 μmol/L順鉑沖擊4次和6次后不同濃度順鉑對親本細胞和耐藥誘導細胞的生長抑制情況。見表1和表2。

2.3耐藥Ecap-109細胞多藥耐藥基因(MDR)表達檢測結果MDR1全長大約4.7 kb，從電泳結果可以看出，在此位置上可見一泳帶，證明提取人食道癌細胞Ecap-109順鉑耐藥細胞有MDR1基因的表達，而親本Ecap-109細胞沒有表達。見圖5。

表1 正常Ecap109細胞和經5 0 μmol/L順鉑沖擊4次后Ecap109細胞的耐藥檢測

IC50：Ecap-109 23.097 μmol/L Ecap-109/cDDP 72.177 μmol/L RI： 3.12

表2 正常Ecap109細胞和經5 0 μmol/L順鉑沖擊6次后Ecap109細胞的耐藥檢測

IC50：Ecap-109 20.561 μmol/L Ecap-109/cDDP 70.869μmol/L RI： 3.45

1.mark 2.親本Ecap-109細胞 3.誘導4次耐藥的Ecap-109細胞 4.誘導6次耐藥的Ecap-109細胞

圖5耐藥Ecap-109細胞MDR表達結果

3 討論

腫瘤細胞耐藥是影響治療效果的重要原因之一。腫瘤耐藥的產生有多種原因，其中有原藥耐藥和多藥耐藥。多藥耐藥大部分發生于單用高劑量給藥或聯合用藥后存活下來的部分細胞[1,2]，也就是腫瘤干細胞(CSCs)。CSCs雖然僅占腫瘤細胞的一小部分，但它卻有強大的自我更新能力，形成與親代細胞完全相同的腫瘤細胞，是腫瘤復發的根源[3,4]。

目前，鉑類藥物是最常用的周期非特異性抗腫瘤藥物，它是多種腫瘤治療藥物的首選。其中，順鉑(DDP)是使用廣泛的化療藥物之一[5]。但是由于鉑類抗腫瘤藥物結構上的相似，使其很容易產生原藥耐藥或交叉耐藥，造成化療治療的失敗[6]。根據這一現象，本實驗用順鉑誘導人食道癌細胞Ecap-109產生耐藥性，建立人食道癌細胞Ecap-109順鉑耐藥模型，為耐藥細胞的治療等研究提供實驗基礎。

我們經過反復實驗，最后選擇了用50 μmol/L順鉑對人食道癌細胞Ecap-109進行反復沖擊的方法，細胞經沖擊后逐漸死亡，后來只剩下少量單個細胞(見圖1)。之后經長時間培養后，所剩細胞逐漸形成集落(見圖2)。將形成的集落用胰酶消化后重新培養，逐漸恢復到原始狀態(見圖3，圖4)。之后，我們用同樣的方法反復沖擊，并用沖擊第4次和第6次的細胞以及親本細胞分別做了耐藥抑制率和耐藥基因檢測，結果證明，經4次和6次沖擊后，人食道癌細胞Ecap-109對順鉑具有較強的耐受力，IC50分別達到72.18 μmol/L和70.87 μmol/L，而親本細胞Ecap-109則分別為23.03 μmol/L和20.56 μmol/L(見表1，表2)，兩者比較有顯著差異(P<0.01)，誘導4次和6次的Ecap-109細胞均有MDR表達(見圖5)。因此，本實驗建立了Ecap-109/DDP耐藥細胞株。該細胞株通過反復凍存、復蘇后，仍對順鉑有較高的耐藥性及MDR的表達。至此，我們建立了具有很好穩定性的耐藥細胞，為尋找抗耐藥腫瘤細胞的藥物及其它耐藥實驗研究奠定了基礎。

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