GBE對大鼠腎間質成纖維細胞TGF-β、CTGF及α-SMA過表達的抑制作用

韓 璐，胡 濤，丁雪峰，楊 玉

(吉化集團公司總醫院 1.檢驗科；2.內分泌科，吉林 吉林132000)

腎間質成纖維細胞是腎臟細胞外基質(ECM)的主要生成細胞。高糖等因素在體內體外均可刺激腎間質成纖維細胞增殖，并刺激其合成并分泌膠原(collagen)、纖連蛋白(FN)及彈性蛋白等在內的多種ECM成分，參與腎間質纖維化過程。轉化生長因子-β(TGF-β)、結締組織生長因子(CTGF)被認為是強效的致纖維化因子，在腎間質纖維化中起重要作用。有研究表明，糖尿病大鼠腎臟二者表達明顯高于正常對照組，表明二者可能在腎間質纖維化發生發展中具有重要作用[1,2]。免疫組化研究顯示，注射脲鏈佐菌素(STZ)4 w后，大鼠腎臟α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達也明顯增加，這可能與成纖維細胞的轉分化作用有關。有學者認為，腎間質成纖維細胞向肌成纖維細胞(MFB)的轉分化數量可作為判斷腎間質纖維化程度的主要指標[3]。銀杏葉提取物(GBE)是銀杏的干燥葉提取物，具有保護心腦血管、改善外周血液循環及降低血清膽固醇等藥理作用。李相軍等發現，GBE可抑制AngⅡ誘導的大鼠腎成纖維細胞增殖及ECM分泌，并能下調TGF-β及CTGF mRNA表達[4,5]。本研究旨在探討GBE對大鼠腎間質成纖維細胞TGF-β、CTGF及α-SMA過表達的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料大鼠腎間質成纖維細胞株NRK49f購自上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖及低糖培養基為Invitrogen產品，胎牛血清產自天津灝洋生物技術公司。GBE注射液由三九藥業有限公司生產，規格5 ml:17.5 mg，含銀杏黃酮苷4.2 mg。兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ECL顯色試劑盒為武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產品。細胞裂解液、Bradford 法蛋白檢測試劑盒由碧云天生物技術公司生產。

1.2細胞分組將處于對數生長期的細胞按1×106/孔接種至6孔板，分為對照組、高糖組及12.5 mg/L和25 mg/L GBE處理組。對照組細胞用無血清DMEM培養，高糖組及12.5 mg/L和25 mg/L GBE處理組，則分別用含GBE終濃度為0、12.5和25 mg/L的無血清高糖DMEM培養。每組設3個復孔，實現重復3次。

1.3WesternBlot檢測培養結束后，以冷磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌細胞2次，每孔加300 μl細胞裂解液反復吹打以充分裂解細胞，經蛋白定量后按50 μg/孔行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳并經轉膜、洗膜、封閉后，用兔抗大鼠TGF-β、CTGF及α-SMA多克隆抗體4℃孵育過夜，再用辣根過氧化物酶標記抗兔多克隆抗體37℃孵育2 h，充分洗膜后用ECL法顯色、曝光后測量X光膠片上條帶密度。

2 結果

2.1各組細胞TGF-β和CTGFwesternblot檢測結果高糖DMEM作用于NRK49f 24 h后，高糖組細胞TGF-β、CTGF蛋白表達量明顯增加，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，與高糖照組比較，GBE各處理組TGF-β、CTGF表達量明顯降低，且GBE高劑量組(25 mg/L)二者表達量明顯低于GBE低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組細胞TGF-β和CTGF western blot檢測結果

分組TGF?β/GAPDHCTGF/GAPDH對照組高糖組GBE12．5mg/L 25mg/L1．00±0．151．76±0．25?1．55±0．12Δ1．28±0．08Δ#1．00±0．122．13±0．14?1．65±0．16Δ1．12±0．19Δ#

與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，ΔP<0.05；與GBE低劑量組比較，#P<0.05

2.2各組細胞α-SMA表達檢測結果Western blot檢測結果顯示，正常組NRK49f細胞未檢測到α-SMA表達，高糖DMEM作用于NRK49f 48 h時可見明顯α-SMA表達，而GBE2個劑量組α-SMA表達量均顯著低于高糖組(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組細胞α-SMA western blot檢測結果

分組α?SMA/GAPDH對照組高糖組GBE12．5mg/L 25mg/L0．00±0．181．00±0．12?0．46±0．08Δ0．58±0．13Δ

與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，ΔP<0.05。

3 討論

研究表明，高糖可刺激腎間質成纖維細胞增殖及ECM表達，糖尿病腎病大鼠腎間質中成纖維細胞明顯增生及ECM生成，腎間質TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表達亦明顯增加[6-9]。除降糖作用外，GBE還可通過降低Ⅳ型膠原mRNA等途徑減少改善2型糖尿病大鼠腎臟ECM的過度積聚，延緩糖尿病腎病及腎間質纖維化發生[10]。

TGF-β分子量25 kD，由兩個分子量為12.5 kD的亞基通過二硫鍵連接而成的同源二聚體，二聚體形式的TGF-β才有生物活性。現已證明，TGF-β是腎間質纖維化過程中最重要的生長因子之一，在腎間質纖維化發生、發展的多個環節起作用。研究表明，TGF-β除直接刺激腎間質成纖維細胞ECM產生外，還可通過促進纖溶酶原激活物抑制物(PAI)和基質金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)的合成而減少ECM降解。CTGF是在TGF-β下游起作用的介質。在CTGF啟動子上有一個特殊的TGF-β反應元件，TGF-β通過此元件誘導CTGF表達，促進腎間質纖維化的形成。楊敏等[11]研究發現，CTGF可修飾或放大TGF-β1的促成纖維細胞生成作用。本研究中，高糖培養液作用于NRK49f 24 h后，可見TGF-β和CTGF蛋白表達量明顯增加，而GBE對此二者有明顯降低作用，表明TGF-β、CTGF通路可能參與高糖所致的腎間質纖維化形成，而抑制其生成與活性可能是GBE腎臟保護機制之一。

α-SMA是常用的肌細胞特異性表達蛋白，常用于平滑肌細胞的鑒定。有研究發現，TGF-β、CTGF均可刺激大鼠腎臟成纖維細胞合成向肌成纖維細胞轉分化，即由本來不表達α-SMA的腎小管成纖維細胞轉分化為有α-SMA表達的肌成纖維細胞。本研究中，高糖刺激NRK49f 48 h后，NRK49f α-SMA表達明顯增加，表明腎間質成纖維細胞可能是腎間質纖維化時肌成纖維細胞的來源之一，在培養液中加入GBE后，α-SMA表達量明顯低于高糖組，表明抑制腎間質成纖維細胞的轉分化可能是GBE抗纖維化的另一機制。

綜上所述，除降糖作用外，GBE還可通過抑制F-CTGF途徑及成纖維細胞轉分化機制抑制ECM合成，保護腎臟結構和功能，提示GBE可能在糖尿病治療中有重要應用價值。

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