1例痤瘡患者面部細菌的分離鑒定及耐藥分析

張 婧,郝羽翀,王 雨*

(1.吉林大學第一醫院，吉林 長春130021;2.吉林大學基礎醫學院)

面部痤瘡是多種機制共同作用的結果，它的發生主要與皮脂腺分泌過多、細菌感染、毛孔堵塞以及炎癥過敏等方面有關，除此之外還與遺傳或者心理壓力等因素息息相關[1]。我們從一例臨床患者面部痤瘡位置分離得1株細菌，對其進行分離純化并結合理化特性進行鑒別，以期對痤瘡患者的病因有更深一步的認識。

1 病例摘要

患者女性，年齡23歲，于2017年3月就診于吉林大學第一醫院皮膚科，患者的痤瘡病程為1年零2月，臨床確診為面部痤瘡患者，近3個月內參加過其他面部臨床研究或接受過皮膚科醫生治療，皮損形態有粉刺及囊腫。病情分度依據Pillsbury分類法,確定為中度(Ⅱ)[2]。用無菌棉簽收集患者痤瘡破處液體，并在無菌生理鹽水中進行溶解稀釋。取含菌的生理鹽水50 μl均勻涂布在血平板上，分別在有氧及無氧條件下，37℃過夜培養。利用厭氧罐培養法，在血平板進行培養，37 ℃過夜后，痤瘡丙酸桿菌的菌落形態呈灰白色或淡紅褐色，菌落約針尖大小，有凸起，表面光滑呈圓形[3]。菌落形態如圖1。挑取血平板上的單個菌落進行革蘭染色[4]，在100倍油鏡下進行觀察并拍攝。痤瘡丙酸桿菌革蘭染色呈陽性(Gram+)，不產芽孢營養類型為異養厭氧型，適應性極強，能適用多種復雜環境。在100倍油鏡下觀察，細菌呈短桿狀，革染呈紫色，為典型的革蘭陽性菌[5]。油鏡觀察結果見圖2。利用經典菌落PCR方法分析鑒別細菌類型，確定從患者病患處分離純化得一株厭氧菌，經梅里埃細菌鑒定系統鑒定，后參照Negin NAGHDI等人的文獻[6]，以5′-AGCTCGGTGGGGTTCTCTCATC-3′，5′-GCTTCCTCATACCACTGGTCATC-3′為引物，PCR 反應體系為50 μl，包括上、下游引物各0.4 μmol/L，模板2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl。反應條件為95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延長1 min，共35 個循環； 72 ℃終末延長5 min。在PCR循環條件下行菌落PCR， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并對PCR產物進行序列測定，經BlastN比對測序結果[7]，按上文條件進行PCR后電泳結果如圖3，條帶大小為1 202 kb，測序結果顯示該株細菌為丙酸痤瘡桿菌，并命名為P.acnes1。為確定菌株對抗生素的敏感性，以便合理用藥，對所分菌株進行耐藥性分析。耐藥性測定系對PCR序列分析后確定為丙酸痤瘡桿菌的菌株經平板稀釋法測定其對抗菌藥物的耐藥性[8]，每種藥物濃度均設50、100、200及400 μg/ml 4個濃度。平板結果顯示，P.Acnes1對檢測的14種抗生素中的5種耐藥，9種敏感抗生素為頭孢吡肟、頭孢米諾、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、克林霉素、鹽酸莫西沙、鹽酸左氧氟沙星和硫酸慶大霉素。在耐藥的5種抗生素中，阿奇霉素、頭孢西丁鈉和頭孢他美的耐受濃度為200 μg/ml，亞胺培南和氨芐西林鈉的耐受濃度為50 μg/ml[9]。藥敏試驗結果見表1。

2 討論

痤瘡是一種毛囊皮脂腺的慢性炎癥，好發于青年。其發生主要與皮脂分泌過多、毛囊皮脂腺導管堵塞、細菌感染和炎性反應等因素密切相關[10]。Wang 等[11]將痤瘡患者鼻部皮膚微生物與痤瘡丙酸桿菌共同培養后發現表皮葡萄球菌可抑制痤瘡丙酸桿菌，實驗結果表明，也許可以通過微生物間相互抑制達到治療痤瘡的目的。研究表明該疾病對患者自我形象和生活質量影響程度很大[12]。本例患者面部油脂分泌量明顯高于正常人，病程約一年，無痤瘡家族史，痤瘡瘢痕主要位于鼻部及下頜，對口服及局部治療藥物反應性差，屬遲發型痤瘡。

本實驗通過傳統的臨床菌株分離[13]，獲得一株在無氧條件下，在血平板上長勢良好，在有氧條件下無法生長的細菌，經過革蘭染色確定為紫色短桿菌，表現為典型的革蘭陽性細菌特征[14]。結合其生長條件，判斷為丙酸痤瘡桿菌，黃小芳等的文章中提及，痤瘡丙酸桿菌是一種革蘭染色的厭氧短桿菌，細胞內寄生，屬于皮膚的正常菌群，一般寄居在皮膚的毛囊及皮脂腺中。隨著青少年的發育成熟，毛囊口出現角栓，皮脂腺分泌功能也明顯增加，因皮脂含有較多脂肪酸等成分，適合P.acnes的生長及繁殖，從而成為痤瘡最主要的病因之一[15]。利用丙酸痤瘡桿菌的保守序列設計引物，進行菌落PCR并結合電泳和測序分析，確定為一株丙酸痤瘡桿菌。在NCBI中進行BlastN操作，與已公布的序列進行比對，一致性在99%，確定為丙酸痤瘡桿菌[16]。

圖1P.acnes1在血平板上的形態圖2經過革染的P.acnes1在100倍油鏡下形態圖3PCR電泳結果

表1 P.Acnes1的耐藥性測定結果

—”表示不耐藥,數字代表耐受的藥物濃度

痤瘡的發生與痤瘡丙酸桿菌的感染密切相關，口服抗生素是治療重型痤瘡有效的方法之一。國際上痤瘡治療共識推薦第二代四環素類藥物包括米諾環素、多西環素等作為痤瘡抗菌治療的首選藥物，其次是第一代四環素類藥物。針對該株細菌的藥敏性實驗，設定50、100、200及400 μg/ml四個濃度梯度，選用14種常見抗生素進行平板梯度稀釋實驗，結果顯示P.acnes1對14種抗生素中的5種有抗性，但并不能對三類(氨基糖苷類、紅霉素、β-內酰胺類)或三類以上抗生素同時耐藥，故并非為多重耐藥菌[17]。通過對該株細菌的鑒定以及耐藥性分析進一步的了解了患者的病因，以期進行更好的護理。確?；颊叩囊缽男?、選用有治療靶點的抗生素及足夠的治療療程是治療取得成功的關鍵。提高痤瘡患病早期就診率是預防重型痤瘡發生的基礎；為患者提供安全、有針對性、足夠療程的綜合治療是提高痤瘡治療效果的關鍵。以正確的態度對待，保證積極樂觀的精神狀態，并注意調整飲食結構，注重面部的清潔衛生，保持良好的生活習慣，為早日治愈打好堅實基礎[18]。

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