miR-135在前列腺癌中的診斷價值研究

趙宇明，張 悅，王 華，郭冬梅，田 寶，張立民，鄭 龍

(1.秦皇島市第一醫院 泌尿外科，河北 秦皇島066000;2.秦皇島市婦幼保健院 婦科，河北 秦皇島066000;3.河北醫科大學分子生物學研究室，河北 石家莊050017)

前列腺癌(PCa)是臨床常見的男性惡性腫瘤，發病率呈明顯上升趨勢，并且向低齡方向發展[1]。臨床常采用直腸指診和血清前列腺特異性抗原(PSA)篩查前列腺癌，但直腸指診的敏感性低、PSA檢測特異性較差，存在一定程度的誤診或漏診。目前發現，在腫瘤發生發展、轉移過程中，細胞釋放腫瘤內源性的miRNA(microRNA)進入外周循環，結合于體內靶基因mRNA3'，誘導miRNA靶基因降解，外周血游離miRNA能夠用于腫瘤診斷與預后[2]。本文采用PCR檢測血清miR-135的表達水平，分析其與 PCa病理參數的的相關性，以便指導臨床診斷，改善患者預后。

1 材料和方法

1.1臨床資料

選取2016年1月至12月我院PCa患者75例、良性增生(BPH)患者52例及40例健康人群，經病理活檢確診。病理分級依據2003年WHO分類標準Gleason評分[3]，根據腺體分化程度，積分為2、3、4分者相當于高分化腺癌，腺體形態完好；5、6、7分者相當于中分化腺癌，腺體伴有少量的發育不全或融合成篩狀；8、9、10分者相當于低/未分化癌，發育不全，融合成篩狀腺體，或缺乏腺體結構，伴壞死。Glerson積分>7分，癌腫分化程度差，伴有浸潤性生長、壞死，染色變化明顯。腫瘤分期按TNM分期標準。其中PCa組術前未行治療，平均年齡(58.33±6.47)歲；BPH患者平均年齡(56.27±5.49)歲，健康患者平均年齡(57.31±5.50)歲，排除伴發糖尿病、心血管疾病、其它惡性腫瘤、精神疾病、腎病等，本研究獲得倫理委員會批準，患者簽署知情同意書，3組年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1RNA提取 收集患者血清300 μl，所有的血清標本保存在-80 ℃。用上海嶸崴達實業有限公司生產的mirVanaTMPARISTMmiRNA試劑盒，提取并測定RNA濃度[4]。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測 以總RNA5 μl為模板，應用上?；鄯f生物科技有限公司生產的TaqManMicroRNA Reverse Transcription試劑盒反轉錄，反轉錄引物為miR-135特異性的莖環引物(ABI)，反應條件控制：85℃5 min，42℃30 min，16℃30 min。熒光定量 PCR總反應體系為20 μl，反應條件控制：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min。在ABI7500實時定量PCR儀上完成，均重復3次反應[5]，計算相對定量表達水平。

1.3統計學處理

2 結果

2.1血清miR-135表達水平

PCa組miR-135表達水平(18.36±3.85)較BPH組(6.11±2.02)和對照組 (5.50±1.52)增加，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 血清miR-135的相對表達水平比較

2.2miR-135表達與PCa的相關性

Glerson積分>7組的 miR-135的表達量要高于Glerson積分<7組，差異有統計學意義(P<0.05)。臨床分期越高，血清miR-135表達越高(P<0.05)，見表2。

3 討論

miRNA是存在于人體內長度為22nt的微小單鏈，屬于內源性表達的小分子RNA，在轉錄后水平調節基因表達，在細胞增殖與凋亡中發揮重要作用[6]。它能夠通過結合于體內靶基因mRNA3'端非翻譯區(3'-UTR),二者發生作用，抑制miRNA靶基因翻譯，誘導其降解,楊曉冬[7]等認為miRNA靶基因在機體中發揮促癌或抑癌功能。

表2 血清miR-135表達水平與 PCa相關性比較%]

miR-135是長度為22nt的非編碼微小單鏈RNA，在轉錄后水平調控基因表達，在體內結合于靶基因miRNA3'端非翻譯區，家族成員包括miR-135a，在機體中抑制Wnt信號通路中APC基因的表達，有促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用，發揮類似癌基因樣的作用[8]。付強[9]等研究證實miR-135a調控JAK2通路，其表達能夠抑制細胞增殖，加速細胞凋亡；miR-135a參與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡，在前列腺癌發生發展過程中，miR-135a發揮重要的調控作用，促使癌細胞由激素依賴轉化為激素非依賴，miR-135a在激素非依賴前列腺癌細胞中低表達，在細胞中外源性高表達后，顯著抑制細胞增殖能力，提示miR-135a具有抑癌基因作用，可以抑制STAT6與DNA結合，抑制STAT6蛋白的表達。

miRNA具有促癌功能，在PCa的腫瘤細胞變異增殖過程中，促癌基因被激活，導致癌細胞增殖增加、凋亡減少，從而導致惡性病變并進一步進展[10]。miRNA在轉錄后水平調控基因表達，miRNA在前列腺癌、BPH及健康者血清中，表達水平由高到低(χ2=5.821,P<0.01)，差距巨大[11]，表明miRNA檢測可作為敏感性較強的腫瘤標志物，指導臨床診斷、評估預后。血清中存在腫瘤特異性miRNA，在PCa患者中，miR-135表達與臨床病理參數密切相關，林楠[12]發現miR-21與miR-155的表達水平在淋巴瘤患者中明顯增高，表達越高預后越差，并且存活率也較低，miRNA基因來源于腫瘤，它的表達量能夠反映腫瘤的性質、大小、臨床分期，為臨床診斷提供參考。李天壽[13]等提出血漿microRNA表達譜可作為PCa非編碼的小分子的標志物，通過miR-30c、miR-1285、let-7c和miR-622 等表達，能夠準確區分腫瘤細胞的性質，診斷出PCa的腫瘤分級、浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期。

本文對三組研究對象進行miR-135水平檢測，發現健康組(5.50±1.52)、良性增生組(6.11±2.02)及PCa組(18.36±3.85)的miR-135表達依次升高，差異具有統計學意義，表明miR-135表達在臨床中能夠能較好地判定前列腺腫瘤性質，區分惡性腫瘤、良性增生或健康人群；同時發現在PCa患者中Gleason積分大于7者其血清miR-135水平明顯增加；臨床分期越高，分化程度越差，miR-135的表達水平越高，表明 miR-135是高風險腫瘤的標志物，可作為PCa診斷和預后的分子標志[14]。

綜上所述，在人類激素非依賴前列腺癌中，miR-135表現為具有促進腫瘤增殖的功能，可作為PCa診斷和預后判斷的標志物，可以通過表達制定治療策略，非侵入性操作，診斷準確率高，有助于降低死亡率，提高患者的生存質量。

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