NRF2 啟動(dòng)子區(qū)-617G/T多態(tài)性與膠質(zhì)瘤易感性的關(guān)聯(lián)

王春輝，胡國(guó)忠，劉 穎，谷潔冰，唐 棟，李松濤*

(1.吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a藥劑科;b神經(jīng)內(nèi)一科)

膠質(zhì)瘤是我國(guó)最常見(jiàn)的神經(jīng)上皮細(xì)胞腫瘤[1]。由于呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織無(wú)明顯界限，難以完全切除，因此極易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。膠質(zhì)瘤的發(fā)病與多種因素有關(guān)，包括環(huán)境暴露和遺傳因素[2,3]。人類(lèi)核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，不僅具有細(xì)胞解毒、抗炎和抗氧化作用，而且在化學(xué)藥物預(yù)防腫瘤中起著正反兩方面調(diào)控作用。膠質(zhì)瘤中NRF2呈差異性表達(dá)[4,5]，NRF2啟動(dòng)子區(qū)-617bp的單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs6721961T等位基因與NRF2蛋白低表達(dá)有關(guān)[6]。查閱文獻(xiàn)，未見(jiàn)該SNP位點(diǎn)rs6721961與膠質(zhì)瘤相關(guān)性的研究報(bào)道。本研究運(yùn)用病例-對(duì)照研究探討rs6721961多態(tài)性與我國(guó)東北地區(qū)膠質(zhì)瘤的關(guān)系，以期為膠質(zhì)瘤的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象

研究對(duì)象分為兩組：膠質(zhì)瘤組和正常對(duì)照組。樣本分別來(lái)源于我院神經(jīng)外科和健康體檢中心，相同時(shí)期收集，均為漢族個(gè)體。

膠質(zhì)瘤組：經(jīng)臨床病理確診為膠質(zhì)瘤患者共156例，平均年齡45.8±16.0歲，中位年齡46歲，其中男性90例，女性66例。星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤各59例，室管膜瘤19例，混合性膠質(zhì)瘤7例，中樞細(xì)胞瘤6例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤6例。按照1997年世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ-Ⅱ級(jí)89例，Ⅲ-Ⅳ級(jí)67例。

正常對(duì)照組：經(jīng)我院體檢中心體檢健康樣本共185例，平均年齡44.5±12.5歲，中位年齡44歲，其中男性100例，女性85例。正常對(duì)照組和膠質(zhì)瘤組年齡和性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病，否認(rèn)腫瘤家族史。

1.2NRF2rs6721961基因分型

采集外周靜脈血2 ml，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中。DNA 提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司，北京)提取DNA，按照說(shuō)明書(shū)操作。運(yùn)用Taqman基因分型技術(shù)對(duì)NRF2 rs6721961進(jìn)行分型。PCR反應(yīng)總體積10.0 μl，含2 × 通用PCR Master mix 5.0 μl，探針0.5 μl，DNA模板20 ng，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體積10.0 μl。7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、2 ×通用PCR Master mix 和探針均購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。PCR 反應(yīng)條件：95.0 ℃ 10 min，95.0 ℃ 15 s,60.0 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用t檢驗(yàn)比較膠質(zhì)瘤組和對(duì)照組年齡差異，采用χ2檢驗(yàn)分析Hardy-Weinberg平衡、兩組間性別差異及NRF2 rs6721961基因型分布，并計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)以評(píng)價(jià)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組樣本NRF2 rs6721961基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律(膠質(zhì)瘤組：χ2=0.004，P=0.95；對(duì)照組：χ2=2.26，P=0.13)。病例組和對(duì)照組中均檢測(cè)到三種NRF2 rs6721961基因型：GG、GT和TT。這三種基因型在對(duì)照組中的頻率分別為48.6%、45.4%和5.9%，而在膠質(zhì)瘤組中分別為39.7%、46.8%和13.5%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，攜帶TT基因型者患膠質(zhì)瘤的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶GG基因型者的2.77倍(χ2=6.59，P=0.01)。G和T等位基因在對(duì)照組中頻率分別為71.4%和28.6%，而在膠質(zhì)瘤組中的頻率分別為63.1%和36.9%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，攜帶T等位基因者患膠質(zhì)瘤的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因者的1.45倍(χ2=5.21，P=0.02)(表1)。根據(jù)性別、年齡和病理分級(jí)進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，以上因素與NRF2 rs6721961多態(tài)性無(wú)關(guān)聯(lián)(表2)。

表1 NRF2 rs6721961多態(tài)性與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性 [n(%)]

表2 NRF2 rs6721961多態(tài)性與膠質(zhì)瘤臨床特征的相關(guān)性 [n(%)]

3 討論

核因子NRF2是一種重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在包括膠質(zhì)瘤的多種腫瘤中差異性表達(dá)[4,5]，通過(guò)多條信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和對(duì)多種化療藥物耐藥[7-9]。

NRF2位于人類(lèi)第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)1帶，由NFE2L2編碼。2007年，Marzec等[10]分析了NRF2啟動(dòng)子區(qū)的SNP功能，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-617bp的rs6721961多態(tài)性影響了NRF2的表達(dá)，減弱了ARE介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。由于rs6721961是一個(gè)功能性多態(tài)位點(diǎn)，因此，多項(xiàng)遺傳易感性研究調(diào)查了其與多種腫瘤的相關(guān)性。Okano等[11]報(bào)道攜帶rs6721961TT基因型的日本非吸煙女性人群更容易患肺腺癌，并且具有更長(zhǎng)的生存期。Hartikainen等[6]報(bào)道攜帶rs6721961 TT基因型的芬蘭人群患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了4.656倍。本研究運(yùn)用病例-對(duì)照研究調(diào)查了rs6721961多態(tài)性與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型的我國(guó)東北人群患膠質(zhì)瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.77倍。推測(cè)可能機(jī)制是rs6721961T等位基因減弱了NRF2與DNA結(jié)合蛋白的親和力，降低了NRF2的轉(zhuǎn)錄，致使NRF2表達(dá)下降，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生。然而，Reszka等[12]則報(bào)道rs6721961多態(tài)性與波蘭人群膀胱癌的發(fā)病無(wú)關(guān)。造成以上不一致結(jié)果的可能原因是：其一、不同類(lèi)型腫瘤可能存在不同的易感基因；其二、不同種族rs6721961 GG基因型分布不同，在波蘭正常人群中的頻率為77.5%[12]，而在本研究人群中的頻率為48.6%。其三、腫瘤是多因素共同作用的結(jié)果，入選樣本的抽樣誤差及不同環(huán)境暴露均可導(dǎo)致不一致的結(jié)果。因此，有必要開(kāi)展不同種族的遺傳多態(tài)性研究，深入探討rs6721961多態(tài)性及基因-環(huán)境交互作用與不同種族膠質(zhì)瘤的相關(guān)性，為膠質(zhì)瘤的易感基因篩選及個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)，NRF2啟動(dòng)子區(qū)rs6721961多態(tài)性是我國(guó)東北地區(qū)膠質(zhì)瘤的易感因素。然而，其與膠質(zhì)瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值及確切的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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