Periostin在大腸癌診斷中的應用

喬 璐，鄭 嵐，楊照微*，何成彥，方 玲

(1.吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033；2.吉林大學口腔醫院 檢驗科，吉林 長春130021)

盡管近些年在結直腸癌的診斷方法和治療手段方面獲得了一定的進展[1]，仍然無法阻止該病死亡率逐步上升的腳步。統計結果顯示：結直腸癌在發達國家中的常見性位列第三，在世界位列第二位[2-4]。許多局限性結直腸癌患者有微轉移的疾病通常在初次診斷中不能被發現，導致診斷后數年疾病復發和死亡。因此，我們認為找到一種與腫瘤的侵襲及轉移相關的標志物，對于降低本病的新發病例數及死亡率至關重要。本研究將樣本分為腫瘤組織及距離腫瘤組織大于5 cm的癌旁正常組織作為對照組，通過二維質譜色譜儀進行篩選：差異蛋白34個，13個上調蛋白。本實驗選定上調表達的骨膜蛋白Periostin作為研究對象。

1 材料與方法

1.1研究對象

收集年齡40-70歲之間的結直腸癌患者的腫瘤組織及其配對的癌旁組織(兩類標本應為相距10 cm以上的組織標本)，男性17例，女性13例。

1.2主要試劑

考馬斯亮藍、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-HCL(pH8.8)、1.0M Tris-HCL(pH6.8)、碘代乙酰胺(IAM)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸鈉、蛋白質定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購于Bio-Rad公司。測序級胰酶、二硫代蘇糖醇(DTT)。

1.3方法

(1)蛋白提取及濃度測定：取清洗干凈的組織標本50 g，加入預冷的蛋白提取試劑中，在低溫環境下靜置20 min，高速低溫(12 000 rpm，4℃)離心1 h，棄掉沉渣取上清。考馬斯亮藍(Bradford)法測定蛋白濃度，蛋白提取樣品保存于-80℃。(2)二維質譜色譜聯用技術鑒定蛋白多肽：取酶切的蛋白水解多肽(蛋白∶胰酶=50∶1)溶解于0.1%FA，二維色譜分離條件設定為：流速2 μl/min，洗脫時間3 h。質譜儀檢測條件：全掃描后附加10次二級掃描，碰撞能量：35%。(3)免疫印跡鑒定蛋白的表達：SDS-PAGE 電泳，經濃縮膠、分離膠將蛋白按照分子量的不同進行分離，轉移分離的蛋白至醋酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗(1∶1000 BSA稀釋)低溫孵育3 h，PBS洗膜/5 min,共計洗膜5次，每次5 min；二抗(1∶2000 BSA稀釋)室溫孵育，PBS洗膜/5 min,共計洗膜5次?；瘜W法(ECL 法)發光顯色。

1.4統計學處理

2 結果

2.1質譜分析結直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白質

將得到的圖譜數據進行分析比對，得到腫瘤組織中的蛋白豐度與癌旁組織的差異性具有統計學意義的蛋白34個，其中Periostin蛋白質譜結果見圖1。

圖1 Periostin蛋白中AAAITSDILEALGR序列肽段的串聯質譜圖

2.2免疫印跡驗證蛋白Periostin

選取未經治療的結直腸癌組織與癌旁組織，進行Western blotting檢測，結果如圖2所示：骨膜蛋白Periostin在腫瘤組織中的表達量高于癌旁正常組織。

A:大腸癌組織；B：大腸癌癌旁組織圖2 Periostin在大腸癌及癌旁組織中的表達

3 討論

結直腸癌在世界范圍內的惡性腫瘤中排名第三[1,2]。多學科治療的進展極大地改善了被診斷為早期疾病的患者的預后，但是被確診患有晚期疾病的患者的預后依然很差[3]。在對人類多種腫瘤組織的研究中均觀察到了細胞粘附蛋白Periostin的蹤跡。 最近的幾項研究表明，肺癌、肝細胞癌、膽管癌、乳腺癌、卵巢癌和結腸癌的血清骨膜素水平被上調[6]。數十位研究人員的研究結果向我們闡述了Periostin對于癌癥診斷具有一定的輔助作用。Periostin最初在成骨細胞中被確定為骨和牙齒形成和維持的重要調節者，目前，骨膜蛋白被認為是一種異功能分泌細胞基質外蛋白并與胚胎發育期間的細胞粘附和運動有關[7,8]。越來越多的證據表明，Periostin是一種基質細胞蛋白，參與許多基本的生物過程，如細胞增殖、細胞侵襲和血管生成[9]。Periostin是膠質瘤惡性腫瘤和潛在的腫瘤復發的強大標志物。抑制Periostin后，膠質瘤干細胞致瘤性的消除為探索靶向Periostin的治療效果提供了支持[10]。本研究，通過二維質譜色譜聯用技術與免疫印跡方法篩選并驗證了骨膜蛋白Periostin在結直腸癌中的上調表達。目前，研究雖然提示我們Periostin蛋白參與了細胞粘附和運動，同時與腫瘤的轉移及血運相關，此外在血清中也能夠檢測到Periostin的表達，我們推測正是由于Periostin的過量表達，一方面，促進了細胞之間的粘附，從而促進細胞的增殖；另一方面，高表達的Periostin增強了細胞的運動，進而促成了腫瘤的轉移。

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