腫瘤免疫微環境相關因子FOXP3在乳腺癌中的表達及臨床病理分析

宮國良，陳靜寧，張元鑫，吳盛桂

(1.汕頭潮南民生醫院 病理科，廣東 汕頭515044；2.汕頭大學醫學院第一附屬醫院 病理科；3.汕頭市金平區婦幼保健院 婦產科)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，目前臨床多采用手術、放療、化療、內分泌治療、免疫治療等聯合治療方法。其中，免疫治療是近年來研究的熱點，是繼手術、放化療和靶向治療之后新興且前景遠大的治療方法，腫瘤的免疫微環境作為免疫治療的核心理論，尤其受到重視，但機制尚不十分清楚[1]。叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子(FOXP3)是腫瘤免疫微環境標志性因子，廣泛用于腫瘤免疫微環境的相關研究[2，3]。因此，本研究選取乳腺癌為研究對象，選擇免疫微環境標志性因子FOXP3及與其表達密切相關的CD8、轉化生長因子-β1(TGF-β1)三種抗體，探討FOXP3與患者年齡、腫瘤大小、轉移情況、分子分型及中醫證型等臨床病理特征的關系，并對FOXP3、 CD8及 TGF-β1三者的表達進行相關性分析，旨在進一步明確腫瘤免疫微環境與乳腺癌臨床病理特征間的密切聯系，及其各因子間的調控機制，為乳腺癌的免疫治療提供新的思路及理論依據。

1 材料與方法

1.1材料收集汕頭潮南民生醫院2014年3月-2017年1月手術治療的乳腺浸潤性導管癌病例82例，手術前均未接受過抗癌治療。患者均為女性，年齡分布31-66歲，平均48.5±17.5歲，所有患者均進行術前中醫辨證分型。術后標本精確測量腫瘤最大直徑后石蠟包埋，4 μm切片，蘇木素-伊紅染色，并常規進行了PR、ER、HER-2及Ki-67免疫組織化學染色，進行分子分型。

1.2方法標本經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規石蠟包埋、切片及染色。免疫組化采用EnVision兩步法，FOXP3多克隆抗體購自英國Abcam公司，CD8(克隆號：C8/144B)單克隆抗體及TGF-β1多克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發有限公司。組織切片65℃烤片后脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗，PBS沖洗5 min×3，滴加—抗室溫孵育1.5 h，PBS沖洗5 min×3，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min×3，DAB顯色，鏡下控制陽性細胞呈棕色為止，充分蒸餾水洗，蘇木素復染1分鐘，脫水，封片。免疫組化均設陽性對照及陰性對照。FOXP3主要表達于細胞漿，CD8表達于細胞膜，TGF-β1表達于細胞漿。

2 結果

2.1FOXP3在乳腺癌中的表達情況FOXP3以細胞漿內出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(圖1)，FOXP3在乳腺癌中最常見的表達部位為細胞漿，其次為細胞漿與細胞核共同表達， 最少見的表達模式是細胞核表達，因此選取陽性表達部位的不同，實驗結論差異較大。我們選取最常見的細胞漿表達模式作為觀察統計的重點。結果采用半定量計分方法， 陽性細胞數按無著色、 陽性細胞數≤20%、21%-50%和>50%分別判為0、1、2、3分，著色強度按細胞漿無著色、淺黃色、深黃色和棕黃色分別判為0、1、2、3分。兩項評分結果相乘>6視為高表達，<6分為低表達。我們檢測的82個乳腺浸潤性導管癌病例中，80例出現細胞漿陽性表達，僅2例陰性，按照高表達和低表達情況分為兩組，其中高表達組50例(60.98%)，低表達32例(39.02%)。

2.2FOXP3的表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系FOXP3的表達與淋巴結轉移、分子分型有關， 與患者年齡、腫瘤直徑及中醫證型無關 (表1)。

表1 FOXP3的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

2.3CD8在乳腺癌中的表達及其與FOXP3相關性分析本研究計數腫瘤間質中CD8陽性細胞的浸潤密度，腫瘤間質CD8陽性細胞指腫瘤浸潤邊界以內的間質中未與癌細胞直接接觸的淋巴細胞(圖2)。低倍鏡下選取淋巴細胞最豐富的區域5個，高倍視野下對該區域CD8陽性淋巴細胞進行計數。結果以5個視野細胞平均值表示CD8陽性細胞的浸潤密度。在本研究中CD8陽性細胞的浸潤密度為50.34±31.64個/HPF，與FOXP3的相關性分析顯示，兩者呈負相關，r=-0.225，P<0.001。

2.4TGF-β1在乳腺癌各中醫證型中的表達情況及其與FOXP3相關性分析TGF-β1主要表達于癌組織細胞漿(圖3)，按無著色、陽性細胞數≤20%、21%-50%和>50%分別判為陰性、+、++、+++。相關性分析顯示，FOXP3與TGF-β1無明顯相關性，r=0.113，P=0.317。

圖1乳腺癌組織FOXP3細胞漿陽性表達EnVision法高倍放大圖2CD8在腫瘤間質淋巴細胞中出現強陽性表達EnVision法高倍放大圖3TGF-β1癌組織細胞漿陽性表達EnVision法高倍放大

3 討論

1889年學者提出“種子和土壤”的假說，將腫瘤細胞比作種子,把腫瘤細胞所處的環境比作土壤,也就是我們說的腫瘤微環境。腫瘤微環境是由非腫瘤基質細胞構成，包括成纖維細胞、免疫細胞、內皮細胞等共同構成的關系到腫瘤發生、發展和轉移的局部穩態環境[4,5]。而腫瘤微環境中的免疫細胞又構成了免疫微環境，免疫微環境作為腫瘤微環境有機整體的重要組成部分發揮著監視和防御作用[6,7]，是腫瘤與免疫系統正式交鋒的地點。免疫微環境可以直接影響腫瘤的預后，在多種惡性腫瘤中發揮著重要作用，其中也包括乳腺癌，在乳腺癌中，免疫微環境既有積極的免疫監視和防御作用，亦有促進腫瘤生長、侵襲的作用，出現這些現象的具體機制尚不十分清楚，這也是研究者們關注的重點。

FOXP3是腫瘤免疫微環境標志性因子，廣泛用于腫瘤免疫微環境機制研究。FOXP3是叉頭樣轉錄因子家族中的成員，2001年由Bmnkow等首次報道，早期研究發現，FOXP3特異地表達在CD4+CD25+調節性T細胞，與其發育和功能密切相關，隨后學者們發現FOXP3在很多惡性腫瘤的癌細胞中也有表達，并且與這些惡性腫瘤的預后有著密切關系[8-10]。

有關FOXP3與乳腺癌的關系，也有少量文獻報道，大都認為FOXP3與乳腺癌的不良預后有關。研究者選用免疫組織化學染色，來觀察FOXP3在癌細胞中的表達，與乳腺癌各臨床病理特征的關系，結果不完全一致，這和所選不同廠家的FOXP3抗體及觀察的免疫組化陽性表達模式有關。在乳腺癌組織中，FOXP3以細胞漿陽性最多見， 其次為細胞漿與細胞核均表達， 最少見的表達模式是僅細胞核表達，因此，選擇不同的陽性部位進行觀察，對結果影響較大，甚至是完全相反的結論。本文選擇最常見的細胞漿陽性模式，通過研究我們發現，乳腺癌組織FOXP3的表達與淋巴結轉移、分子分型有密切關系，與患者年齡、腫瘤直徑及中醫證型無關。乳腺癌實質FOXP3蛋白表達與淋巴轉移密切相關，在FOXP3高表達組中，淋巴結轉移率為56%，而FOXP3低表達組中，淋巴結轉移率僅為25%，兩者存在顯著差異，提示FOXP3在乳腺癌淋巴結轉移中發揮作用，其作用機制可能為FOXP3抑制體內免疫微環境的抗腫瘤效應，使乳腺癌細胞發生腫瘤逃逸，從而促進了腫瘤浸潤進展和轉移。

同時，我們對FOXP3的表達與乳腺癌分子分型的關系做了進一步分析，我們發現在LuminalA組中，FOXP3的高表達率最高。李靜平等[11]對FOXP3細胞核陽性、細胞質陽性與乳腺癌分子分型的關系分別作了統計， 在LuminalA型乳腺癌組織中，FOXP3細胞核表達率最高，而三陰型乳腺癌中細胞質FOXP3表達率最高，并認為FOXP3在乳腺癌細胞核中的表達，發揮改善乳腺癌預后的作用，而細胞質表達與預后不良相關，國外也有類似的研究結果[12]。這一結論與我們得出的結論不太一致，原因除了和所選的抗體及免疫組化條件有關外，可能還有較復雜的機制，乳腺癌腫瘤免疫微環境對分子分型的影響，不能簡單的分析為僅受幾個因子的影響，還需要較深入的研究。

FOXP3的陽性表達，在不同腫瘤直徑及不同年齡組中無明顯差異。本文首次對FOXP3的表達與乳腺癌中醫證型的關系進行了分析，結果兩者無明顯相關性，但不同中醫證型組乳腺癌CD8與TGF-β1存在明顯差異性表達，說明中醫證型和腫瘤免疫微環境還是有密切關系。

在腫瘤免疫微環境中，CD8和TGF-β1也是兩個重要的因子[13，14]。而且CD8和TGF-β1與FOXP3在理論上有著密切關系，CD8+T細胞是腫瘤免疫微環境中最重要的效應執行細胞，抑制其活性，能夠有效影響機體的免疫防御功能。FOXP3可以抑制或殺傷CD8+T細胞，達到腫瘤細胞免疫逃逸的目的，我們的實驗結果也證實了該理論。在本研究中CD8陽性細胞的浸潤密度與FOXP3表達的相關性分析顯示，兩者呈現負相關，r=-0.225，P<0.001，也就是說FOXP3可以抑制或殺傷CD8+T細胞的作用是明確的，其理論機制有兩種可能性，其一為FOXP3直接抑制或殺傷CD8+T細胞，其二為FOXP3通過調控TGF-β1間接抑制或殺傷CD8+T細胞，因此我們又對FOXP3與TGF-β1的相關性做了分析，發現兩者無明顯相關性，因此，我們認為，FOXP3是直接抑制或殺傷CD8+T細胞，達到調控免疫微環境的作用，從而促使了腫瘤細胞的免疫逃逸。

綜上所述，腫瘤免疫微環境標志性因子FOXP3表達于乳腺癌，并通過直接抑制或殺傷CD8+T細胞發揮作用,從而說明腫瘤免疫微環境與乳腺癌的密切關系，為乳腺癌的免疫治療提供新的思路及理論依據。

[1]Shumway NM,Ibrahim N,Ponniah S,et al.Therapeutic breast Cancer vaccines:a new strategy for early-stage disease[J].Bio Drugs,2009,23(5):277.

[2]Liu F,Lang R,Zhao J,et al.CD8+ cytotoxic T cell and FOXP3+ regulatory T cell infiltration in relation to breast Cancer survival and molecular subtypes[J].Breast Cancer Res Treat,2011,130(2),645.

[3]Niu J,Jiang C,Li C,et al.FOXP3 expression in melanoma cells as a possible mechanism of resistance to immune destruction[J].Can Immu,2011,60(8):1109.

[4]Kothari AN,Mi Z,Zapf M,et al.Novel clinical therapeutics targeting the epithelial to mesenchymal transition[J].Clin Transl Med,2014,3(1):35.

[5]Kat3 coactivators in somatic stem cells and cancer stem cells:biological roles,evolution,and pharmacologic manipulation[J].Cell Biol Toxicol,2016,32(1):61.

[6]DeNardo DG,Brennan DJ,Rexhepaj E,et al.Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy[J].Cancer Discov,2011,1(1):54.

[7]Mahmoud SM,Lee AH,Paish EC,et al.The prognostic significance of B lymphocytes in invasive carcinoma of the breast[J].Breast Cancer Res Treat,2012,132(2):545.

[8]黃 焰，張瑰紅，吳正升，等.FOXP3在乳腺癌中的表達及臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志，2009，25(1)：19.

[9]Zuo T,Wang L,Morrison C,et al.FOXP3 Is an X-Linked Breast Cancer Suppressor Gene and an Important Repressor of the HER-2/ErbB2 Oncogene[J].Cell,2007,129(7):1275.

[10]Ebert LM,Tan BS,Browning J,et al.The Regulatory T Cell-Asso-ciated Transcription Factor FoxP3 Is Expressed by Tumor Cells[J].Can Res,2008,68(8):3001.

[11]李靜平，張香梅，鄭麗華，等.乳腺浸潤性導管癌組織FOXP3表達及其預后意義[J].中華腫瘤防治雜志，2017，24(1)：23.

[12]Takenaka M,Seki N,Toh U,et al.FOXP3 expression in tumor cells and tumor-infiltrating lymphocytes is associated with breast cancer prognosis[J].Mol Clin Oncol,2013,1(4):625.

[13]Junttila MR,de sauvage FJ.Influence of tumour micro-environment heterogeneity On therapeutic response[J].Nature,2013,501(7467):346.

[14]Voduc KD,Cheang MC,Tyldesley S,et al.Breast cancer subtypes and the risk of local and regional relapse[J].J Clin Oncol,2010,28(10):1684.