胸水γ干擾素特異性效應(yīng)T細(xì)胞檢測對結(jié)核性胸膜炎診斷的價(jià)值評估

王 俊,戴亞新,劉 君,王盼盼,尚忠波,周希科,翟樺梓,歐勤芳,裴 豪

(無錫市第五人民醫(yī)院 結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214005)

結(jié)核性胸膜炎(TBP)是由結(jié)核菌或其代謝產(chǎn)物進(jìn)入胸膜腔，引起胸膜腔胸膜對結(jié)核毒素出現(xiàn)免疫反應(yīng)引起滲出的結(jié)果，作為一種常見、多發(fā)的疾病，約占滲出性胸腔積液病因的54.8%[1]。目前結(jié)核性胸膜炎診斷的主要手段是影像學(xué)、胸腔積液細(xì)菌學(xué)檢查(抗酸染色涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng))、胸膜活檢等。細(xì)菌學(xué)檢查陽性檢出率低于5%～25%[2]，且檢測周期長，給臨床早期診斷帶來了困難。胸膜活檢被視為診斷結(jié)核性胸膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但由于此項(xiàng)技術(shù)的缺點(diǎn)是對患者有一定的創(chuàng)傷，因此不作為診斷結(jié)核性胸膜炎的常規(guī)手段。γ干擾素特異性效應(yīng)T細(xì)胞檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的診斷結(jié)核病的免疫學(xué)檢測技術(shù)，該方法通過檢測結(jié)核分枝桿菌(Mtb)特異性抗原刺激外周血單核細(xì)胞(PBMCs)γ干擾素(INF-γ)的分泌情況診斷結(jié)核桿菌的感染。本文通過比較外周血、胸水中結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(CFP-10、ESAT-6)刺激特異性效應(yīng)T細(xì)胞分泌INF-γ的斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)，探討胸水檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷和鑒別診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1研究對象

病例均來源于無錫市第五人民醫(yī)院結(jié)核科。實(shí)驗(yàn)組：結(jié)核性胸膜炎組患者35例，男性31例，女性4例，年齡20-87歲，平均(62.5±21.4)歲，均為初治患者；對照組：腫瘤性或其他非結(jié)核炎性感染性胸膜炎患者40例，男性32例，女性8例，年齡24-83歲，平均(61.8±20.3)歲。上述患者均排除艾滋病感染。

入選標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組：①胸腔積液結(jié)核分枝桿菌抗酸染色涂片和(或)培養(yǎng)陽性，細(xì)菌培養(yǎng)陰性；②胸膜活檢符合結(jié)核表現(xiàn)；③臨床具備TBP的表現(xiàn)，如低熱、盜汗、乏力、胸悶、滲出性胸腔積液等，且抗結(jié)核治療有效。符合以上三條標(biāo)準(zhǔn)之一即可入組。對照組：①胸水為滲出液，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和(或)抗酸染色涂片陰性；②胸膜活檢排除結(jié)核且抗結(jié)核治療無效。符合以上兩項(xiàng)之一者可入組。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集治療前患者靜脈血5 ml，同時(shí)留取患者新鮮胸腔積液50 ml，2 h內(nèi)送檢，4 h內(nèi)完成細(xì)胞分離。

1.2.2INF-γ的效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn) 根據(jù)試劑盒說明書(Oxford Immunote Ltd.，Oxford，UK)進(jìn)行。分離外周血或胸水PBMCs，并將PBMCs濃度稀釋成2.5×106/ml的細(xì)胞終溶液。在有γ-干擾素抗體的微孔板上的4個(gè)孔中，依次加入細(xì)胞培養(yǎng)液50 μl作為陰性對照孔、結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽ESAT-6抗原50 μl作為測試孔A、結(jié)核分枝桿菌特異混合CFP-10抗原50 μl作為測試孔B、植物血凝素50 μl作為陽性對照孔，然后在每孔中各加入100 ml細(xì)胞終溶液。在37℃，保持濕潤的含有5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育16-20小時(shí)。后用PBS洗板4次，每個(gè)反應(yīng)孔加入50 μl標(biāo)記抗體工作液，4-8℃孵育1小時(shí)后洗板。加底物于常溫避光條件下顯色7分鐘后在顯微鏡下進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。當(dāng)滿足以下條件時(shí)判定為陽性結(jié)果：陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0-5個(gè)，測試孔A或B斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥ 6個(gè)；陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)6-10個(gè)，測試孔A或B斑點(diǎn)數(shù)必須≥2倍的陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)。如果不符合上述標(biāo)準(zhǔn)且陽性對照孔反應(yīng)正常則檢測結(jié)果為陰性。

1.2.3胸水腺苷脫氨酶(ADA)檢測 采用酶動(dòng)力學(xué)法。以奧林派斯5400全自動(dòng)生化分析儀作為檢驗(yàn)儀器，選用北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司試劑盒，以腺苷脫氨酶>25 U/L作為陽性判定值。

2 結(jié)果

2.1結(jié)核組CFP-10與EST-6分別刺激外周血效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)數(shù)為28.6±21.2，65.9±34.6，刺激胸水效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)數(shù)為150.0±104.5,152.9±105.4(表1)。CFP-10與EST-6刺激胸水效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)明顯高于刺激外周血效應(yīng)T細(xì)胞釋放的斑點(diǎn)數(shù)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1)。

2.2通過 ROC 曲線分析得出，CFP-10與EST-6分別刺激外周血效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)試驗(yàn)曲線下面積分別為AUC=0.745，AUC=0.815。CFP-10與EST-6分別刺激胸水效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)試驗(yàn)曲線下面積分別為AUC=0.944，AUC=0.938。分析胸水ADA曲線下面積得出AUC=0.6(表1)。胸水效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)試驗(yàn)對于結(jié)核的診斷效果明顯高于外周血及胸水ADA檢測，特異性，敏感性都能達(dá)到90%以上。

表1 結(jié)核組CFP-10與EST-6分別刺激外周血/胸水效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)數(shù)

注：*胸水、全血對應(yīng)刺激物ESAT-6、CFP-10的T-spot．TB計(jì)數(shù)曲線下面積(ROC)的比較，P<0.001。

圖1 結(jié)核組：CFP-10與EST-6分別刺激外周血/胸水效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)數(shù)

3 討論

IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)(IGRAs)被認(rèn)為是近年來結(jié)核病診斷方面的一個(gè)重大突破。IGRAs的診斷原理為：受到結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T細(xì)胞，再次遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生IFN-γ，因此對全血或分離的外周血PBMC在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后產(chǎn)生的IFN-γ進(jìn)行檢測，從而判斷機(jī)體是否存在結(jié)核分枝桿菌病感染。該項(xiàng)技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，且不受機(jī)體免疫力及卡介苗接種的影響，目前已被美國疾病控制預(yù)防中心(CDC)的最新指南中被推薦作為一種替代結(jié)核菌素皮試(TST)的檢測方法[4]。

結(jié)核分枝桿菌感染后細(xì)胞免疫應(yīng)答起主要免疫應(yīng)答作用，CD4+T淋巴細(xì)胞為優(yōu)勢的免疫細(xì)胞亞群有向病灶遷徙的作用，并在感染部位產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，在病變局部發(fā)揮抗結(jié)核的免疫作用[5]。本文研究發(fā)現(xiàn)采用CFP-10與EST-6刺激胸水效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)明顯高于刺激外周血效應(yīng)T細(xì)胞釋放的斑點(diǎn)數(shù)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過ROC曲線分析

發(fā)現(xiàn)，胸水效應(yīng)T細(xì)胞釋放INF-γ的斑點(diǎn)試驗(yàn)對于結(jié)核的診斷效果明顯高于外周血及胸水ADA檢測，特異性、敏感性都能達(dá)到90%以上。表明應(yīng)用γ干擾素特異性效應(yīng)T細(xì)胞檢測對結(jié)核性和非結(jié)核性胸膜炎有鑒別診斷作用。

ADA是一種在淋巴細(xì)胞和淋巴組織中表達(dá)，并與機(jī)體細(xì)胞免疫活性密切相關(guān)的核酸代謝酶，在一些惡性疾病(如淋巴瘤)、感染性疾病、結(jié)締組織疾病侵犯胸膜時(shí)，胸腔積液中ADA水平也會(huì)升高[6]。本文結(jié)果顯示，胸水ADA ROC曲線下面積0.6，其特異性，敏感性遠(yuǎn)不如胸水/外周血T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，胸水γ干擾素特異性效應(yīng)T細(xì)胞檢測對于結(jié)核性胸膜炎的診斷有著較高的敏感性和特異性，對于結(jié)核性胸膜炎患者和非結(jié)核性胸膜炎的早期診斷及鑒別診斷具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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