肝細胞核因子1α基因rs7310409多態性與健康成人血清AFP水平顯著相關

史瑞崎，邵冬華，何美琳，梁國威

(北京大學航天臨床醫學院 檢驗科，北京100049)

在遺傳持續性甲胎蛋白(HPAFP) 家族中的研究顯示，AFP基因上游200 bp啟動子區域內的2個肝細胞核因子-1α(HNF1α)結合位點的堿基變異(-119G>A和-55C>A)是HPAFP者血清AFP非疾病性顯著升高的原因[1,2]。這2個位點變異可導致HNF1α結合AFP啟動子序列同源性的增加，增強HNF1α結合AFP基因啟動子的能力，導致AFP基因轉錄活性增強，進而引起血清AFP水平顯著持續升高。上述研究提示HNF1α在調控AFP基因表達中起著關鍵作用，也提示基因變異與血清AFP水平具有顯著相關性。rs7310409(A/G)，位于HNF1α基因第1內含子內，是與人體多種復雜性狀或疾病相關聯的多態性位點。全基因組關聯分析研究(GWAS)顯示，rs7310409多態性與C-反應蛋白(CRP)[3]、谷氨酰氨基轉移酶[4]和胰腺癌[5]皆具有顯著相關性。我們推測rs7310409與血清AFP水平也具有顯著相關性，并在616例漢族成年健康人中驗證rs7310409與血清AFP水平的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象收集我院2017年1月至2017年8月健康體檢人員資料。根據調查問卷和實驗室檢測指標，將患有急、慢性乙型、丙型病毒性肝炎(HBsAg抗原和HCV抗體陽性)、飲酒(男性≥140 g/周，女性≥70 g/周)、懷孕、肝癌和其它各種腫瘤的調查對象剔除。共計獲得完整資料的調查對象616例(男性：407例，年齡范圍：25-65 歲；女性：209例，年齡范圍：25-65歲)。

1.2方法(1)臨床基本資料調查：測量所有受試者身高、體重，并計算體質量指數(BMI)；血壓取3次測量平均值；(2)實驗室檢查：使用真空采血管(美國BD公司提供)抽取空腹靜脈血，血液離體2h內檢測完畢。采用全自動生化分析儀(日本OLYMPUS公司AU 2700)測定甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度和低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C和LDL-C)、空腹血糖(FPG)、CRP、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)，由日本OLYMPUS公司提供配套試劑。血清AFP測定采用美國雅培公司 i2000 免疫分析儀(USA) 進行檢測，批內、批間變異系數(CV值)分別為3.5%-4.7%和4.1%-8.1%，由雅培公司提供配套試劑。

1.3非酒精性脂肪肝(NAFLD)診斷采用美國Philips公司(IU-22型)B型超聲影像儀，行腹部B型超聲進行診斷[6]。

1.4外周血基因組DNA提取EDTA抗凝外周全血200 μl用于基因組DNA提取，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒，按試劑盒說明操作。提取后的基因組DNA -80℃凍存備用。

1.5rs7310409分型檢測采用等位基因特異性引物(ARMS原理)結合TaqMan-MGB探針的熒光定量PCR方法(ARMS-TaqMan方法)進行檢測[7]，根據ΔCt 值(ΔCt=A等位基因反應體系Ct值減去G等位基因反應體系Ct值)進行分型。引物和探針采用ABI 公司的TaqExpress 軟件(Foster City,CA)進行設計(見表1)，由北京賽百盛基因技術有限公司和美國ABI公司合成。(1)ARMS-TaqMan法：擴增片段長度64bp，反應體系20 μl，其中基因組DNA 2 μl，2×Master mix 8 μl和Ehance inhibit 1 μl[天根生化科技(北京)有限公司提供]，上、下游引物各1 μl(終濃度0.25 μM)，TaqMan探針1 μl(0.25 μM)，水6 μl。反應條件為95℃ 2 min，95℃15 s、60℃ 1 min、(40個循環)。循環閾值(Ct值)設定在0.03，基線設定為自動設定基線，測定儀器為ABI 7500 熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。(2)測序：PCR擴增片段長度674 bp，按常規PCR條件擴增，北京諾賽基因組研究中心有限公司完成測序。

表1 rs7310409多態性ARMS-TaqMan分型測序法的引物和探針序列

注：A和G等位基因引物3′端-2位引入錯配堿基A (原堿基為C)，以增加基因分型特異性。

2 結果

2.1rs7310409等位基因ARMS-TaqMan法分型檢測結果

對616例研究對象采用ARMS-TaqMan方法進行基因分型檢測，檢出成功率100%，其中AA型的ΔCt=-13.06±1.25(107例)，AG型的ΔCt=0.30±0.48(298例)，GG型的ΔCt=13.6±1.21(211例)，等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.010,P=0.919)。A和G等位基因反應體系Ct值的變化情況見圖1。

ARMS-TaqMan方法分型后隨機選取AA型、AG型和GG型各3例，經直接測序證實100%符合。

2.2616例研究對象的基本資料

616例研究對象基本資料見表2，男、女組間的BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG、HDL-C、CRP和ALT存在顯著差異(P<0.05)；年齡、LDL-C、AFP和NAFLD無顯著性差異(P>0.05)；rs7310409等位基因型分布男、女間無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 ARMS-TaqMan方法檢測616例研究對象的A和G等位基因反應體系的Ct值散點圖

表2 616例研究對象的基本資料

注：P值：男、女組間比較；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓

2.3rs7310409等位基因型的血清AFP水平變化情況

血清AFP水平在AA型(107例)最低，為3.33 ± 1.57 ng/ml，AG型(298例)為3.59 ± 1.47 ng/ml，在GG型(211例)最高，為4.05 ± 1.91 ng/ml，3組間皆具有統計學差異(P=0.038～P<0.001)。與GG型比較，攜帶AA型健康人群的血清AFP水平的平均值下降17.8%，AG型下降11.4%。見圖2。

2.4rs7310409等位基因型的血清AFP水平相關性分析

以AFP作為因變量，不同模型的線性回歸(linear regression models)分析顯示，無協變量，控制年齡和性別，以及控制年齡、性別、CRP、LDL-C、ALT、AST和 NAFLD后，皆顯示rs7310409等位基因型與血清AFP水平顯著相關(P<0.001)，見表3。

圖2rs7310409等位基因型的血清AFP水平95%可信區間(95%CI)比較圖。P值為AFP轉化為自然對數后進行組間比較值。

表3 rs7310409等位基因型的血清AFP水平相關性分析

注：模型1：無矯正因子；模型2：控制年齡和性別；模型3：控制年齡、性別、CRP、LDL-C、ALT、AST和 NAFLD

3 討論

本研究在中國漢族健康人群中，首次證實血清AFP水平與HNF1α基因rs7310409多態性具有顯著相關性，其相關性不受性別、年齡、炎癥指標CRP、血脂LDL-C、肝功指標ALT和AST以及脂肪肝的影響。與rs7310409 GG型比較，攜帶AA型的表觀健康人群表現為血清AFP水平的平均值降低17.8%，而AG型降低了11.4%。

HNF1α屬于肝細胞核因子家族，位于染色體12q24.31，在肝臟較多表達，是調節肝臟內基因特異性表達的轉錄因子。HNF1α可調控超過100多種基因表達，其中大部分潛在的調控結合位點都位于被調節基因的啟動子區域，并與其它轉錄因子相互作用共同調控基因表達[8]。人AFP基因啟動子位于5′端轉錄起始點上游-200 bp內，能與AFP啟動子結合的反式作用因子包括肝細胞核因子、核因子、CAAT結合/增強子結合蛋白(C/CEP)和成熟肝細胞AFP啟動子結合蛋白(NP)等[9]。其中，HNF1α和HNF1β基因翻譯的蛋白通過識別AFP啟動子Ⅰa和Ⅱ′區的5′-GTTAATNATTAAC-3′序列，并與其它蛋白形成同源或異源二聚體作用于該DNA序列增強AFP基因轉錄活性[8]。點突變方法證明HNF1α結合區之一Ⅱ′區突變時，導致約65%的AFP基因抑制，如Ⅰa區突變則導致約50%的AFP表達抑制，表明HNF1α基因及其結合區序列堿基變異對AFP基因表達起著重要作用[9]。

rs7310409多態性與血清AFP水平變化的確切機制有待于進一步的研究。rs7310409 位于HNF1α基因內含子1區，屬于非編碼核酸變異，根據國際人類基因組單體型計劃Hap Map3中國漢族人群數據，rs7310409多態性與HNF1α基因的2個非同義編碼的多態性位點rs1169288 (r2=0.741) 和rs2464196 (r2=0.633)存在顯著連鎖不平衡，這2個SNP位點變異可導致氨基酸改變，進而可能影響HNF1α翻譯的蛋白活性，從而影響AFP基因表達，其確切機制有待于進一步研究。另外，rs7310409多態性與血清AFP水平相關也可能是rs7310409多態性與其它影響AFP基因表達的多態性、突變位點存在顯著連鎖不平衡所致。同時，近年來研究提示在許多疾病相關基因中位于內含子上的突變可影響pre-mRNA的剪接過程，最常見的剪接突變是通過產生或增強剪接位點或產生新的分支點而導致異常剪接[10,11]。因此，rs7310409位點變異可能影響HNF1α基因的mRNA的剪接過程，進而影響HNF1α翻譯的蛋白質的活性，從而影響AFP基因表達，其確切機制有待于進一步研究。

根據Hap Map3數據，不同種族人群中rs7310409多態性的最小等位基因頻率(MAF)分布具有顯著差異。本研究中A等位基因的MAF=0.329，與歐洲人群的MAF=0.420和非洲人群的MAF=0.333頻率基本相似，但與日本人群的MAF=0.535具有顯著差異。因此，rs7310409多態性與血清AFP的相關性有待于在不同種族人群中進一步驗證。

綜上所述，本研究在中國漢族健康人群中發現HNF1α基因rs7310409多態性與血清AFP具有獨立的顯著相關性，攜帶AA型、AG型等位基因的健康人群皆表現為血清AFP水平顯著降低。由于AFP不只是一個腫瘤特別是肝細胞癌的標志物，還與肝細胞癌的發生發展、預后，甚至基因治療靶點有關[12,13]，因此，AFP表達變化的分子機制研究顯得尤為重要，本研究為血清AFP水平變化提供了新的遺傳決定因子。

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