功能性糖生物制備關鍵技術研究

功能性糖是指一大類具有甜味和特殊保健功能，能作為蔗糖替代品的碳水化合物，主要包括功能性低聚糖、功能糖醇、功能性單糖及一部分功能性多糖。功能性糖具有抗齲齒、低能量值、降低血清膽固醇、降血壓、保護腸道等生理活性，是健康產業的重要原料。而利用酶或微生物催化方法生物制備功能性糖是一個廣受關注的研究領域。

功能性糖生物制備技術難點在于構建或篩選特異性糖酶與微生物，并建立高效生物催化過程控制技術。中國專利CN201710196964.1涉及一種生產低聚果糖的方法，包括以下步驟：采用連接肽連接果糖基轉移酶和葡萄糖氧化酶，然后在宿主菌中進行融合表達，得到融合蛋白；將融合蛋白和過氧化氫酶加入蔗糖水溶液中混勻，進行催化反應，得到低聚果糖。CN201810033883.4公開了一種β-半乳糖苷酶的突變體及其制備方法和應用，其通過將β-半乳糖苷酶中的特定位點氨基酸進行突變，轉入重組菌后，并在優化后的條件下進行酶轉化，突變體生產的低聚半乳糖產率達到59.8%，較野生酶提高70%左右，實現了低聚半乳糖產量的提高，具有極高的工業化應用。CN201210012038.1公開了一株產β-半乳糖苷酶的菌株及用該酶生產低聚半乳糖的方法，涉及一株從土壤中篩選而來的阿耶波多芽孢桿菌（Bacillusaryabhattai）SK22.003，保藏編號為CCTCC NO：M2011464。以此阿耶波多芽孢桿菌為發酵菌株，以乳糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源及無機鹽組成發酵培養基，發酵生產β-半乳糖苷酶，發酵后經檢測，在發酵液中酶活達到1～25 U/mL。將β-半乳糖苷酶添加到5%～60%乳糖溶液中催化合成低聚半乳糖，轉化4～36 h，產率達35%以上。CN201610053213.X公開了一種高效合成雙果糖酐III的方法，先使用菊糖蔗糖酶將蔗糖轉化為菊糖，不分離聚糖，再使用菊糖果糖轉移酶轉化菊糖合成功能性雙糖雙果糖酐III。該發明菊糖合成雙果糖酐III的轉化率能夠達到40%～54%。為了獲得較為純的雙果糖酐III，用酵母除去反應液中的小分子單糖，最終所獲得的較為純的雙果糖酐III容易分離純化，具有廣闊的市場應用前景。CN201410327029.0涉及一株產菊糖果糖轉移酶的菌株，其分類命名為氯酚節桿菌（Arthrobacter chlorophenolicus）SK33.001，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2013387。以此節桿菌為出發菌株，以菊糖為碳源，與氮源及無機鹽組成發酵培養基，發酵生產菊糖果糖轉移酶。發酵培養基以菊糖，硝酸鈉為主要碳源和氮源，發酵后經檢測，在發酵液中菊糖果糖轉移酶酶活達2～100 U/mL。將菊糖果糖轉移酶添加到1%～30%的菊糖溶液中生產雙果糖酐III，轉化3～24 h，轉化率達到75%以上。CN201210040790.7公開了一種D-塔格糖3-差向異構酶固定化方法，步驟是：1）預處理菌體獲得目的酶液；2）預處理離子交換樹脂；3）向處理好的大孔離子交換樹脂中加入D-塔格糖3-差向異構酶液進行吸附后，加入戊二醛溶液進行交聯，用去離子水洗滌以除去游離酶和未交聯的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向異構酶，固定化酶活回收率可達50%以上。CN201410314872.5公開了一種提高D-塔格糖-3-差向異構酶儲藏穩定性的方法，其以一種類球紅細菌SK011為出發菌株，發酵產的D-塔格糖-3-差向異構酶，離心、高壓破碎，再超濾濃縮后添加一定的穩定劑。該穩定劑包括以下組分：防腐劑0.1～0.5 g/dL、糖類2～6 g/dL、醇類2～6 g/mL、鹽類0.5～2.0 mmol/L，其中防腐劑為對羥基苯甲酸甲酯（Met），糖類為果糖，醇類為肌醇，鹽類為MgSO4。該發明的穩定劑組分簡單，且對D-塔格糖-3-差向異構酶的粗酶液保護效果較好，25℃下儲存15 d，可使酶液的酶活保留率由不加穩定劑的2.2%提高到97.74%。

利用酶或微生物催化方法生物制備功能性糖，必須加強對催化劑本身、催化反應過程、催化劑的表達等方面全面系統的研究，優化改造其物質轉化功能與轉化效率；同時加強反應分離耦合技術、生物轉化過程調控技術、過程工程優化放大等集成研究，實現高效節能與環保的轉化工藝放大，解決實驗室成果產業化中的瓶頸問題。