季節性流感疫苗研究進展

于志君，崔力文，程凱慧，高玉偉

流感是由流感病毒引起的一種可在人和多種動物間傳播的呼吸道傳染病[1]。根據流行程度和規模的不同，流感流行可分為流感大流行和季節性流感流行。根據抗原性和基因序列的不同，流感病毒可以分為A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒和D型流感病毒4種類型[2-3]。其中A型流感病毒可引發流感大流行，A型流感病毒和B型流感病毒均可引發季節性流感流行。A型流感病毒根據表面蛋白血凝素（hemagglutinin, HA）和神經氨酸酶（neuraminidase, NA）抗原性的不同可分為18種HA亞型和11種NA亞型[4-5]，目前引起季節性流感疫情的主要有2種亞型，H1N1亞型和H3N2亞型[6]。B型流感病毒分為2種類型，B/Yamagata/16/88樣B型流感病毒（Yamagata系）和B/Victoria/2/87樣B型流感病毒（Victoria系）[7]，均可引發季節性流感疫情。綜上所述，目前可引發季節性流感疫情的流感病毒主要有4種，分別是H1N1亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒以及2種B型流感病毒。

溫帶氣候條件下，季節性流感主要發生在冬季，而在熱帶地區，全年都可能發生流感，疫情暴發不規律[8]。季節性流感的特征包括高熱、咳嗽、頭痛、咽痛、流鼻涕、肌肉和關節痛以及嚴重的身體不適[9]。多數人在1周內康復，臨床癥狀消失。季節性流感從感染到發病的時期稱為潛伏期，約為2 d。季節性流感的流行可嚴重影響任何年齡段的人群，但出現并發癥風險最高的是孕婦、6～59個月兒童、老人、患有慢性疾病（艾滋病、哮喘、慢性心肺疾病等）的人群以及衛生保健人員[10]。根據WHO的報道，季節性流感每年都會在世界范圍內肆虐，對老人、兒童以及免疫功能低下人群的危害尤其嚴重，每年會奪走大約50萬人的生命，對公共衛生安全構成巨大威脅[11]。疫苗是目前應對季節性流感疫情最有效的手段，因此，WHO為了應對季節性流感疫情，每年都會在2—3月、9月召開會議，推薦南、北半球季節性流感疫苗病毒株，其中2—3月是針對本年度的北半球流感季（北半球通常在每年10月至次年5月間發生季節性流感流行，2月為高峰），而9月則是針對下一年度的南半球流感季。此外，全球最新的季節性流感監測信息都可從WHO網站（http://www.who.int/inf l uenza/surveillance_monitoring/updates/en/）上獲取。

目前常用的季節性流感疫苗分為兩大類，一類是滅活疫苗，另一類是減毒活疫苗，其中滅活疫苗主要為裂解疫苗。此外，目前在研的季節性流感疫苗還包括病毒樣顆粒（virus-like particles,VLPs）疫苗、細胞培養流感疫苗等。本文將結合最新的研究進展，綜述目前季節性流感疫苗的研究和應用情況。

1 常用季節性流感疫苗

1.1 裂解疫苗 流感病毒裂解疫苗是通過采用WHO推薦的流行毒株，經過雞胚孵化培養收獲病毒，再結合滅活疫苗生產工藝制備而成[12]。主要生產過程包括收獲流感病毒，通過裂解劑在適當的裂解條件下裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留有效抗原成分 HA蛋白和NA蛋白，去除裂解劑以及純化有效抗原成分等步驟，制備的流感病毒裂解疫苗可有效保持流感病毒的免疫原性，還能夠降低疫苗接種后不良反應發生的幾率，具有良好的安全性[13]。

我國目前使用的季節性流感疫苗主要是流感病毒裂解疫苗[14]。2018年以前，我國生產的流感病毒裂解疫苗全部為三價流感疫苗，然而三價疫苗在預防季節性流感疫情方面有時候會出現覆蓋不全面的問題。例如，2017—2018年季節性流感季，我國季節性流感疫苗株組分包括A1型病毒（WHO當年推薦的H1N1亞型流感病毒流行株）、A3型病毒（WHO當年推薦的H3N2亞型流感病毒流行株）和BV型病毒（WHO當年推薦的Victoria系B型流感病毒流行株）。而2017年12月—2018年初，我國各地流感疫情明顯增多，且該高發季，以Yamagata系B型流感病毒毒株占流行優勢，H1N1亞型流感病毒和H3N2亞型流感病毒共同流行[15]。由于本季三價流感疫苗含有的B型流感毒株成分并非是我國占流行優勢的Yamagata系毒株，進而導致流感疫苗的保護效果受到一定的影響，引發流感疫情[16-17]。為了覆蓋近年來全球流感病毒流行的主要亞型，研發使用四價流感疫苗就成為當前疾病防控的一種迫切需求。2018年6月8日，我國國家食品藥品監督管理局批準了華蘭生物疫苗有限公司等企業的四價流感病毒裂解疫苗的生產注冊申請，獲批上市的四價流感病毒裂解疫苗除包含普通三價流感疫苗的A1、A3、BV型病毒外，還包含BY型病毒（WHO當年推薦的Yamagata系B型流感病毒流行株），這也是2017—2018年我國流感季流行的主要病毒株，該四價疫苗主要用于預防3歲及以上人群流感病毒的感染。四價流感病毒裂解疫苗是對我國流感病毒疫苗品種的有力補充，將與三價流感疫苗一起共同對我國防控季節性流感疫情發揮重要作用。

流感病毒裂解疫苗的臨床不良反應主要包括頭疼、出汗、肌肉疼、關節疼、高熱、感覺不適、寒戰、疲倦、瘙癢、蕁麻疹或非特異性皮疹等，此外注射部位有可能會出現發紅、腫脹、疼痛、皮膚出血以及硬結等局部反應。以上臨床不良反應不需任何治療，癥狀通常在1～2 d內自然消退。

1.2 亞單位疫苗 20世紀70和80年代，在裂解疫苗的基礎上，又研制出了亞單位表面抗原HA和NA疫苗，通過選擇合適的裂解劑和裂解條件，將流感病毒膜蛋白HA和NA裂解下來，選用適當的純化方法得到純化的HA和NA蛋白。亞單位型流感疫苗具有很純的抗原組分，可用于兒童。1980年英國首次批準使用該種疫苗，而后擴展到其他國家。多年的臨床應用表明亞單位疫苗與流感裂解疫苗同樣具有很好的免疫效果和臨床安全性，接種人體后可刺激機體產生相應的抗體[18]。流感病毒亞單位疫苗的臨床不良反應與流感病毒裂解疫苗的基本相同，但發生幾率更低。

1.3 減毒活疫苗 相較于流感滅活疫苗，流感減毒活疫苗有眾多優點，包括避免肌肉注射造成的疼痛、接種人群范圍更廣、能激發較好的黏膜免疫及細胞免疫和免疫持續時間較長等[19]。

目前上市的流感減毒活疫苗主要是以雞胚生產的冷適應性減毒活疫苗。冷適應性減毒活疫苗具備冷適應性、溫度敏感性和減毒性這3個特性。冷適應特性是指病毒能夠在25 ℃和33 ℃進行高效的復制；溫度敏感性是指A型流感病毒在39 ℃時不能復制，B型流感病毒在37 ℃時不能復制；減毒性是指病毒對小鼠和雪貂的致病性顯著降低，無致死性[20]。這樣的冷適應減毒活疫苗具備良好的安全性和有效性。研究發現，HA和NA是流感病毒基因組中最易發生變異的基因節段，而冷適應減毒活疫苗母本株中與冷適應及減毒特性相關的氨基酸突變位點位于除HA和NA以外的6個內部基因上，因此冷適應減毒活疫苗母本株的遺傳性狀比較穩定[21]。

2003年和2012年，美國相繼批準上市了以雞胚生產的三價流感減毒活疫苗和四價流感減毒活疫苗。冷適應減毒活疫苗的制備流程為分別以A型流感病毒A/Ann Arbor/6/60 （H2N2）和B型流感病毒B/Ann Arbor/1/66作為冷適應減毒活疫苗母本株，將其內部PB1、PB2、PA、NP、M和NS 6個基因與WHO推薦的流行株的HA和NA基因進行重配，進而獲得流感冷適應減毒活疫苗。A/Ann Arbor/6/60 （H2N2）和B/Ann Arbor/1/66是由Maassab等[22]研制而成。Maassab等將這2株病毒在雞胚上低溫連續傳代，使其具備冷適應性、溫度敏感性和減毒性這3個特性，而以其為基因骨架制備而成的流感冷適應減毒活疫苗也具備相同的3個特性。這種冷適應性減毒疫苗可以通過滴鼻免疫，避免肌肉注射時所產生的疼痛，且能產生持久的體液免疫，以及良好的黏膜免疫和細胞免疫。除了美國外，俄羅斯以A/Leningrad/134/17/57 （H2N2）為基因骨架制備而成的流感冷適應減毒活疫苗也已成功應用達數十年之久[22]。

值得注意的是，目前傳統的冷適應性流感減毒活疫苗大都以雞胚為基質進行生產，存在一定的缺點。首先，病毒在雞胚上進行連續傳代，在其適應的過程中，HA往往容易發生突變，從而不能與流行株匹配完好，因此不能保證更好的免疫效果；其次，生產過程中存在外源因子污染的可能，收獲的雞胚尿囊液需要不斷純化去除外源因子及雜蛋白等；第三，生產周期長，生產過程繁瑣，雞胚來源受到限制，生產規模小，疫苗產量不足以應對流感大流行。因此，以傳代細胞系為基質生產減毒活疫苗成為發展趨勢。國內外用來生產流感疫苗的連續傳代細胞系主要有犬腎細胞（MDCK細胞）、非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）和人視網膜母細胞瘤細胞（PER.C6）等[23-24]。目前美國MedImmune等公司以上述細胞為基質生產的流感疫苗已經上市，而且生產規模最大可達6000 L。此外有研究表明，采用非洲綠猴腎細胞生產的冷適應流感減毒活疫苗遺傳性狀穩定，有利于通過重配來生產減毒活疫苗。

流感減毒活疫苗的臨床不良反應主要包括骨骼肌痛、滲出性中耳炎等，此外，在15～35個月的幼兒中應用冷適應減毒疫苗有增加哮喘的傾向，因此不建議3歲以下兒童使用。

2 新型季節性流感疫苗研究進展

2.1 細胞培養流感疫苗 與目前的流感疫苗生產方法相比，細胞培養流感疫苗的方法克服了現有生產工藝的許多不足，顯著增加了疫苗產量，降低了生產成本和時間。過去60多年來，用于生產流感疫苗的病毒一直是在SPF雞胚中培養的。然而一方面，并不是每枚雞胚都可以用來生產疫苗，只有經過認證的養雞廠才可以提供SPF雞胚；另一方面，每枚SPF雞胚一次只能注射一種病毒，但是典型的流感疫苗包含3種或4種病毒組分（即三價或四價流感疫苗），導致現有流感疫苗生產效率不高。現有方法需要大量合格的SPF雞胚。以美國為例，為全美人口生產足夠的流感疫苗需要多達數億枚的SPF雞胚。而細胞培養法則克服了上述缺點。此外，細胞培養法生產流感疫苗還有助于人類靈活應對流感大流行，用SPF雞胚培養流感病毒，須提前對生產疫苗的數量做出精確規劃，而在流感大流行期間，很難在短時間內購置生產疫苗所需的大量的SPF雞胚，而細胞培養法則可以在短時間內制造出大批量流感疫苗來應對流感大流行疫情。此外，細胞生產的流感疫苗和雞胚生產的流感疫苗在安全性和免疫原性方面沒有顯著差別。Reisinger等[25]評估了細胞生產的三價流感疫苗與雞胚生產的三價流感疫苗在安全性和免疫原性方面的差別，他們在超過600名＜50歲的成人志愿者中開展臨床試驗，按照1∶1比例接種了細胞生產三價流感疫苗或雞胚生產三價流感疫苗，結果未發現兩種疫苗在安全性和免疫原性方面存在顯著差異。此外，通過非洲綠猴腎細胞細胞生產的冷適應減毒活疫苗在成人滴鼻免疫試驗中也被證明具有良好的安全性和免疫原性[26]。

2.2 病毒樣顆粒疫苗 目前上市的季節性流感疫苗主要包括裂解疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗，這些疫苗都需要在雞胚或哺乳動物細胞中增殖后才能產生足夠的抗原，導致這些疫苗的生產過程需要消耗大量的時間和金錢，而流感VLPs疫苗可以有效解決傳統疫苗的上述缺點[27]。

VLPs是由病毒結構蛋白組裝且不含病毒遺傳物質的空殼結構。由于VLPs不含病毒核酸，因此具有較高的安全性。此外，VLPs可以刺激機體產生較強的體液免疫和細胞免疫，免疫原性強。目前通常選擇昆蟲桿狀病毒表達系統來生產流感VLPs，所產生的VLPs與天然流感病毒形態相似。研究表明，H1N1亞型VLPs疫苗可展示與母本病毒HA和NA蛋白空間構象一致的抗原表位，進而誘導針對HA和NA的特異性抗體產生，目前已在臨床試驗中證明有效[28]。通過動物實驗，Ross等[29]證明一種包括H1N1亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒和一種B型流感病毒的三價VLPs能夠為機體提供針對不同季節性流感病毒的保護。通過皮膚貼片微針注射技術和動物實驗，Quan等[30]證明含有海藻糖的H1N1亞型VLPs能夠給機體提供長時間、高抗體滴度的免疫保護，小鼠在免疫1年后仍可抵抗H1N1亞型流感病毒的致死性攻擊。Wang等[31]研究表明，通過滴鼻免疫的途徑，嵌合鞭毛蛋白的H1N1亞型VLPs能夠引起顯著的黏膜免疫反應。目前Novavax公司的三價和四價季節性流感VLPs疫苗已進入人體臨床試驗階段，但尚無季節性流感VLPs疫苗上市。

2.3 其他季節性流感疫苗 除了細胞培養疫苗和病毒樣顆粒疫苗外，還有一些季節性流感疫苗也在研發中，包括復制缺陷型疫苗、添加 MF59佐劑的流感疫苗等。Wacheck等[32]發現NS1復制缺陷型H1N1季節性流感疫苗通過鼻內接種的方式接種志愿者后，志愿者體內可產生有效的流感中和抗體，且未發現除鼻腔炎癥狀或頭痛等常見疫苗不良反應以外的其他不尋常的不良反應。Vesikari等[33]發現添加佐劑MF59的季節性流感疫苗可增強機體接種疫苗后的免疫應答水平。

3 結 語

自1918年西班牙流感大流行以來，每次流感大流行后都會出現新的季節性流感病毒株來取代或與之前季節性流感病毒株共同流行，當前季節性流感病毒由2種A型流感病毒（H1N1亞型流感病毒和H3N2亞型流感病毒）和B型流感病毒（Yamagata系和Victoria系）組成。季節性流感已成為影響全球的重要疾病負擔，對公共衛生安全和經濟社會的健康發展構成重要威脅。流感疫苗是應對季節性流感疫情的有效手段，雖然偶爾也會出現由于WHO推薦的疫苗株與各國當季實際流行的病毒株不匹配而引發的季節性流感疫情程度顯著加重的事件，但總體上流感疫苗在應對季節性流感疫情和保護人類健康方面做出了不可磨滅的貢獻。

在合理利用現有的三價和四價流感滅活疫苗以及流感減毒活疫苗的基礎上，各國也在積極研發安全、高效和低成本的新型流感疫苗，包括細胞培養流感疫苗、VLPs疫苗等，未來各種新型流感疫苗的上市將會是對現有流感疫苗品種的有力補充，它們將與現有流感疫苗一道共同在人類防控季節性流感疫情的過程中發揮重要作用。