布魯氏菌病流行菌株的鑒定與分析

王會敏 ，張洪軍 ，李秀慧 ，陳瑞蘭 ，路廣計 ，張秀麗 ，劉建民

（1.圍場縣動物疫病預(yù)防控制中心 068450；2.河北省動物疫病預(yù)防控制中心 050000；3.圍場縣農(nóng)牧局 068450）

布魯氏菌病（Brucellosis）簡稱布病，是由布魯氏菌屬（Brucella）的細(xì)菌（簡稱布魯氏菌）引起的一種人畜共患病，為《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定報告的乙類傳染病之一，在世界各地都有廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其在發(fā)展中國家，是受到普遍關(guān)注的世界性公共衛(wèi)生問題。全世界現(xiàn)有布魯氏菌病患者約500600萬人，年新發(fā)病人數(shù)約有50萬，全世界每年因布魯氏菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)30億美元[1]。

布魯氏菌分為6個經(jīng)典的種，其中羊種、牛種、豬種、犬種4個種能夠使人致病。而牛種和羊種是最為常見的人布病的病原體。據(jù)中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心2013年定點監(jiān)測數(shù)據(jù)統(tǒng)計，牛的場群陽性率34.13%、樣品平均陽性率4.02%，羊的場群陽性率51.18%、樣品平均陽性率4.32%。由于帶菌動物是其他動物和人類布魯氏菌病的傳染源。因此從源頭抑制畜間布魯氏菌病的疫情上升趨勢是控制人間布魯氏菌病的重要前提[2]。我國人間布病的發(fā)病數(shù)呈逐年上升趨勢，病原學(xué)監(jiān)測研究顯示在我國引起人發(fā)病的布魯氏菌菌株主要是羊種3型[3]。

本研究從某地區(qū)分離布魯氏菌病流行菌株，并對其進(jìn)行鑒定。從而掌握此地區(qū)布魯氏菌病的傳染源和疫情流行情況，為制定切實可行的布魯氏菌病綜合性防控措施提供前期基礎(chǔ)。

1 試驗材料

采集牛的組織樣品及牛奶樣品，采集15頭陽性牛共45份樣品（牛奶及組織）。培養(yǎng)基、恒溫CO2培養(yǎng)箱。其他實驗耗材。

2 試驗方法

將采集的臟器進(jìn)行研磨后，無菌組織勻漿接種于150個選擇性培養(yǎng)基，同時將乳汁離心沉淀上接種于50個選擇性培養(yǎng)基中，然后將75個培養(yǎng)平皿放于普通培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，75個培養(yǎng)基放于含有5%～10%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)5d進(jìn)行觀察。

將未生長細(xì)菌的平皿，繼續(xù)培養(yǎng)10～20d后，繼續(xù)觀察。

疑似陽性進(jìn)行菌落觀察，挑取單菌落進(jìn)行單菌落劃線25個平皿培養(yǎng)，同時進(jìn)行結(jié)晶紫染色，挑取光滑型菌落接種于斜面培養(yǎng)基，進(jìn)行CO2的需求和H2S的產(chǎn)生試驗，用對硫堇、復(fù)紅染料進(jìn)行敏感性測試，用特異性抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)試驗。

3 試驗結(jié)果與分析

25頭75份樣品接種75個培養(yǎng)基初篩結(jié)果（見表1），分離菌株革蘭氏染色檢測結(jié)果（見圖1），分離菌株Bruce-Ladder檢測結(jié)果（見圖2、圖3），分離菌株生化鑒定試驗（見表2）。

表1 培養(yǎng)基初篩結(jié)果

25份樣品通過培養(yǎng)基進(jìn)行初篩后，發(fā)現(xiàn)16份疑似菌落，其余未見疑似菌落，布魯氏菌病檢測為陰性。16份疑似菌落經(jīng)鑒定13份牛種3型，3份羊種1型。

3.1 菌落的形態(tài)

25份勻漿在布氏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長5d后，16份樣品的培養(yǎng)基上可見生長的菌落，菌落無色、圓潤、表面光滑（見圖1）。

3.2 布魯氏菌株的PCR鑒定

挑取16個平板培養(yǎng)基上的疑似菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。以牛種A544標(biāo)準(zhǔn)株和羊種16M標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對照。鑒定結(jié)果表明，16個疑似菌株中有13株約750bp的特異性片段，與布魯氏菌陽性對照一致。空白對照未見特異性片段（見圖2、圖3）。

3.3 生化鑒定

應(yīng)用常規(guī)生化試驗對PCR鑒定的牛種3型與羊種1型及陰性菌進(jìn)行鑒定。采用布魯氏菌特異性血清A、M分別與待檢菌株的培養(yǎng)物進(jìn)行玻片凝集試驗，同時還進(jìn)行CO2需要、H2S產(chǎn)生、染料抑菌試驗。分離的3株細(xì)菌對CO2無依賴，不產(chǎn)生H2S、在硫堇和堿性復(fù)紅染料培養(yǎng)基中均能生長，9株陰性菌菌株鑒定后仍為陰性菌（表2）。

圖1 分離菌株革蘭氏染色檢測結(jié)果

圖2 分離菌株Bruce-Ladder檢測結(jié)果

4 討論

我國流行的布魯氏菌主要有羊種、牛種、豬種，其中羊種對人的感染率最強(qiáng)，豬種次之，牛種較弱。此次分離到的16株地方菌株，經(jīng)鑒定13株為牛種3型布魯氏菌，3株為羊種1型布魯氏菌。2013年錢振宇、姜霞、賈肇一等人研究，分離的8株菌株經(jīng)傳統(tǒng)分型方法鑒定均為羊種菌，羊種1型1株，羊3型6株，粗糙型羊種菌1株[4]。僅有羊種1型人畜共有，其他菌型在人間還未見報道。這也表明目前感染布魯氏菌病的羊是主要的傳染源，印證我國布魯氏菌病流行菌株的感染強(qiáng)度，提醒我們對牛、羊布魯氏菌病的監(jiān)測是控制動物布魯氏菌病的有效途徑。

病原的分離是確診布魯氏菌的標(biāo)準(zhǔn)，分離的病原進(jìn)行種型的鑒定是控制、預(yù)防和根除布魯氏菌病的關(guān)鍵[5]。但現(xiàn)基層動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)受到人員、設(shè)備及經(jīng)費的影響，主要采用血清學(xué)檢測的方式進(jìn)行檢測，無法開展病原學(xué)監(jiān)測，血清學(xué)方法存在一定的假陽性，易造成誤殺，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖者的經(jīng)濟(jì)收入。因此，找尋一種方法或者幾種方法相結(jié)合、敏感性高的血清學(xué)檢測方法，對掌握布魯氏菌病的流行及分布情況具有重要的意義。

圖3 分離菌株Bruce-Ladder檢測結(jié)果

表2 分離菌株生化鑒定試驗結(jié)果