CRISPR/Cas9系統的脫靶效應及其介導的非編碼RNA編輯在人類癌癥中的應用

吳家棟 綜述，肖 瑞 審校

(內蒙古醫科大學分子病理學重點實驗室，呼和浩特 050059)

成簇規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)/CRISPR蛋白9(Cas9)是一種多功能的基因組編輯技術，被稱為分子剪刀，廣泛應用于遺傳因子功能的研究、遺傳疾病的臨床前研究、癌癥研究、藥物發現、精神疾病研究及植物應用等領域。CRISPR/Cas9系統被發現于多種細菌和古細菌物種中，已經成功地被用于編輯真核生物基因組[1-2]。目前，越來越多的數據表明CRISPR/Cas9系統不僅可以靶向蛋白質編碼基因組，而且可以靶向人類的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)[3-5]。然而，CRISPR/Cas9系統也有其局限性，它存在嚴重的脫靶效應，這可能導致基因組不穩定性并破壞其他正常基因的功能[6-7]。癌癥是導致人類死亡的主要原因之一[8]，盡管腫瘤的綜合治療已取得了令人振奮的成果，但是腫瘤的復發及放化療過程中出現的不良反應等問題大大降低了癌癥患者的生活質量[9]，而CRISPR/Cas9系統可以糾正導致癌癥的突變，并且是一種可以在基因水平保護患者的治療技術[3]，因此，CRISPR/Cas9系統的出現拉開了癌癥治療的新序幕。本文通過總結CRISPR/Cas9系統的脫靶效應及其在ncRNA相關基因組編輯中的最新應用，旨在為腫瘤治療的深入研究甚至臨床治療提供新思路。

1 CRISPR/Cas9系統的概述

迄今為止，已經開發了3種可編程核酸酶用于基因組編輯，包括鋅指核酸酶(ZFN)[10]，轉錄激活劑樣效應子因子核酸酶(TALEN)[11-12]和CRISPR相關蛋白(Cas)系統[13]的RNA引導的核酸酶(RGNs)。在這些核酸酶中，根據其指導RNA和DNA之間的Watson-Crick堿基配對識別目標DNA的Cas9核酸酶實施最簡單，并且迅速成為基因組工程中最流行和有力的工具。CRISPR/Cas9系統是來自細菌和古細菌的適應性免疫系統，可檢測和降解來自噬菌體和質粒的侵染性DNA[14]。1987年末，ISHINO等[15]在大腸桿菌中首次發現了聚類重復片段被一系列間隔序列中斷，該現象后被稱為CRISPR。到目前為止，研究人員已經發現了10多種不同的CRISPR/Cas系統，根據其不同的機制將其分為3類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)和許多亞型[16-17]。其中CRISPR/Cas9是一種在化膿鏈球菌中應用的Ⅱ型CRISPR系統，由于其具有高效率和高準確性，是哺乳動物中使用最廣泛的系統[18]。Cas9介導的基因組編輯有3個要求：(1)單鏈向導RNA(single guide RNA，sgRNA)序列，CRISPR/Cas9系統是第一個用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統，部分原因是它含有一個相關的易編程的sgRNA，只有20個核苷酸長的識別序列[1-2，19]。 sgRNA由具有與靶位點互補序列的CRISPR RNA(crRNA)和分別轉錄并部分與crRNA互補的反式激活的crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)組成[1，20-21]。(2)具有核定位信號的Cas9蛋白，為了發揮基因組編輯功能，CRISPR/Cas9系統還需要與這兩種RNA組分緊密相關的關鍵酶組分Cas9核酸酶[18]，這些RNA需要將Cas9蛋白引導到靶位點并激活Cas9核酸酶。(3)前間區序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，sgRNA與Cas9蛋白結合形成復合物，sgRNA與Cas9蛋白結合形成復合物，并嚴格識別位于靠近PAM的3′末端側翼的靶向互補DNA序列，其通常由NGG或NAG(N可為A，T，G或C)組成，然后啟動DNA雙鏈斷裂(DSBs)[9]。從理論上講，帶有PAM的任何基因組序列都可以由Cas9用特定的sgRNA進行編輯，由于基因組中PAM的高發生率，CRISPR/Cas9系統中的sgRNA幾乎可以靶向所有的基因。

2 CRISPR/Cas9系統的脫靶效應

雖然CRISPR/Cas9系統與ZFN、TALEN等其他的基因組編輯技術相比有許多優勢，但它仍有一些嚴重的缺點亟待解決，例如脫靶效應，也就是說Cas9可能會錯誤地結合到目標位點之外的序列內并產生突變，引起一些嚴重的后果[5，22-23]。SCHAEFER等[24]采用全基因組測序檢測經CRISPR處理的小鼠細胞的脫靶情況，結果顯示，在經CRISPR/Cas9體內編輯后誘導出高數目的突變，該研究表明CRISPR/Cas9系統的脫靶效應是一個廣泛存在的現象。這種脫靶效應已經通過不同的體內和體外方法進行了徹底分析[8-9，25]，主要是由于sgRNA的識別序列與非靶點DNA發生了局部匹配，主要原因有：(1)一般情況下，sgRNA不能識別和編輯任何鄰近PAM的非靶點DNA位點(長度為10～12 bp)，發生堿基錯配，且不能識別3個以上的非靶點DNA位點。經典的通過體外篩選結合高通量測序的方法檢測CRISPR/Cas9系統在HEK293T細胞的脫靶情況的研究表明，Cas9的sgRNA有多達5個錯配[25]。(2)當脫靶位點DNA序列長度比sgRNA多或少幾個堿基時會形成DNA凸起或RNA凸起，從而完成其他堿基的正確配對。即使脫靶位點DNA序列長度比sgRNA的識別序列的長度差5 bp，仍能通過形成多個凸起的形式進行堿基配對并介導CRISPR/Cas9系統進行DNA切割[26]。

2.1CRISPR/Cas9系統脫靶效應的影響因素

2.1.1sgRNA 雖然Cas9的靶點特異性地被sgRNA的20nt引導的序列區嚴格控制著，但幾項初步研究表明，sgRNA鄰近PAM的10～12 bp的堿基配對更能決定Cas9的靶點特異性，并且通常比其余的向導RNA(gRNA)序列更重要[2，18]。此外，sgRNA的GC含量也與特異性密切相關。在一項CRISPR/Cas9介導誘變的研究中觀察到，sgRNAs的PAM序列的最近端區域其誘變效率與GC含量呈正相關[27]。研究表明，在最接近PAM序列的6個堿基對的序列中，具有至少4個GC的sgRNA具有超過60%的可遺傳突變率，這提示可以根據PAM附近序列的GC含量選擇有效的sgRNA。

2.1.2PAM CRISPR/Cas9系統進行切割的必要條件就是PAM序列區，也就是說即使靶點序列與sgRNA序列完全匹配，如果沒有PAM序列，Cas9也不能進行切割[28]，而DNA的切割效率也取決于PAM序列[29]。NGG(N可為A，T，C或G)是PAM的既定序列。然而，最近的研究表明，盡管與NGG相比只有約五分之一的結合效率，Ⅱ型CRISPR系統也可以使用NRG(其中R為G或A)作為PAM序列。幾項研究報道，NRG序列是人EMX基因座中CRISPR/Cas9介導的DNA切割的主要非既定PAM[9，30]。PAM序列中每個堿基的結合頻率不同。第1個核苷酸是最不固定的，其中G在接近50%的結合位點，而第2個位置，G在大于90%的結合位點[9，31]，表明NRG不是CRISPR/Cas9序列設計的最佳PAM。因此，NRG PAM序列對Cas9 DNA切割的確切作用在很大程度上尚不清楚[32]。

2.1.3Cas9蛋白和其他因素 研究顯示，將純化的Cas9蛋白和sgRNA直接輸送到細胞中，可導致脫靶效應降低，這是因為Cas9-sgRNA核糖核蛋白復合物在分娩后幾乎立即切割染色體DNA并在細胞中迅速降解[33-34]。脫靶效應還可能與細胞型特異性有關，并且高度取決于特定細胞類型的DNA雙鏈斷裂(DBS)修復途徑的完整性[35]。此外，CpG位點的DNA甲基化也可能會阻礙Cas9在細胞中的結合效率[36]。

2.2降低脫靶效應的策略

2.2.1改變sgRNA序列 通過截短sgRNA的3′末端、縮短與sgRNA的5′末端的靶點互補區域3nt或添加2個鳥嘌呤核苷酸到sgRNA的5′末端，可以大大降低脫靶反應，并可在一些脫靶位點減少約5 000倍突變的可能[25，37]。同時，RNA引導的內切核酸酶(RNA-guided endonuclease，RGEN)使用這些改變的sgRNA也可以降低脫靶效應。

2.2.2控制Cas9/sgRNA復合物的濃度 如果增加轉染的DNA量，則增加了Cas9/sgRNA復合物的濃度，雖然增加了正確靶點的結合率，但也增加了脫靶效應；如果減少轉染的DNA的量，則減少了Cas9/sgRNA復合物的濃度，通過增加靶點專一性導致靶內切割減少，即脫靶效應減少，但正確靶點的結合率也隨之降低[38]。因此，必須考慮靶內切割效率和脫靶效應之間的平衡。所以未來對Cas9和sgRNA的優化設計需要考慮在提高Cas9特異性的同時而不犧牲靶內切割效率[9，25，39]。

2.2.3應用雙切口措施 盡管可以設計高度特異性的sgRNA，但是Cas9的脫靶活性卻降低了其靶向位點的數量，為了克服這個缺陷，有研究者將Cas9蛋白修飾得到其突變型D10ACas9切口酶(Cas9n)，Cas9n替換野生型Cas9蛋白[40-41]。這些Cas9n需要一對sgRNA編輯1個位點，由于Cas9n只有1個結構域，只能通過切割DNA單鏈產生1個切口，因此Cas9n會在每個sgRNA結合的位置形成單鏈切口，兩個相鄰的單鏈切口會引起DBS，DBS形成后細胞會進行修復。而在脫靶位點處，單鏈切口則無法形成DBS。因此，該方法在保持基因切割效率的同時，具有最小程度的脫靶效應。目前，該方法已經被其他許多實驗室廣泛應用[39-40，42]。

2.2.4fCas9系統 為了進一步提高DNA的切割特異性，研究者已經合成了具有FokI核酸酶結構域(fCas9)的無催化活性的Cas9(dCas9)的融合物(FokI-dCas9)，FokI-dCas9編輯目標DNA位點的特異性比野生型Cas9高140倍以上[43-44]。fCas9系統要求當兩個FokI-dCas9彼此靠近形成二聚體時才可進行DNA切割。該方法在很大程度上降低了非靶向位點的DNA切割[44]。

3 CRISPR/Cas9系統介導的ncRNA編輯在人類癌癥中的應用

3.1CRISPR/Cas9系統中的微RNA(miRNA)編輯 目前，許多研究已經表明CRISPR/Cas9系統是ncRNA相關基因組編輯或調控的最佳選擇[45-52]。miRNA作為主要的ncRNA之一在CRISPR/Cas9相關領域已被廣泛研究。CHANG等[45]證明了CRISPR/Cas9系統在初級miRNA結構上產生的改變可導致成熟的miRNA在體內和體外下調，同時，這項研究還表明正確設計CRISPR/Cas9中sgRNA可顯著將同一家族中具有高度保守序列的miRNA的脫靶效應最小化。ZHOU等[53]的研究中利用CRISPR/Cas9系統成功敲除了肝癌細胞系中的miRNA-3188，發現miRNA-3188 KO能有效地抑制細胞生長、侵襲和遷移，并抑制裸鼠中的異種移植物腫瘤生長。另一項研究表明，慢病毒CRISPR/Cas9載體在將插入和缺失引入前體miRNA序列中是高效的，通過使用該方法研究者成功地破壞了miRNA-21的表達，并發現前體miRNA-21序列的破壞可導致卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲的減少。除了編輯或調節上述的miRNA之外，CRISPR/Cas9系統在各種癌細胞或生物體中也顯示出對其他miRNA如miRNA-137、miRNA-93、miRNA-309、miRNA-126a/b等的廣泛應用[47-51]。

3.2CRISPR/Cas9系統中的長鏈非編碼RNA(IncRNA)編輯 除了miRNA之外，另一種主要調控多種生物學過程的ncRNA，即IncRNA已經被CRISPR/Cas9系統成功調控。尿路上皮癌抗原1(UCA1)是膀胱癌中上調的IncRNA，可以通過特定設計的CRISPR/Cas9的gRNA來靶向，并在體內和體外有效地被抑制[54]。可見，CRISPR/Cas9系統可調節IncRNA的表達，并可為臨床治療癌癥提供新方法。微小的基因的缺失或插入可能不一定使某個非編碼基因的功能喪失，這可能是將CRISPR/Cas9系統應用于非編碼基因的限制之一。為了克服這個障礙，HO等[55]采用同源重組技術，將標記基因整合到基因組中，通過CRISPR/Cas9系統成功地將UCA1、IncRNA-21及AK023948分別在HTC-116和MCF-7細胞中敲除。在SHECHNER等[56]的研究中，研究者開發了CRISPR-Display(CRISP-Disp)法，一種使用Cas9將大分子RNA載體部署到DNA基因座的有目標性的定位方法，研究者發現至少長4.8 bp的功能性RNA結構域可以插入CRISPR gRNA的多個位點中，從而允許構建具有天然lncRNA的Cas9復合物，這種方法可能為癌癥領域中的IncRNA研究開辟一條途徑。

4 小 結

目前CRISPR/Cas9系統作為第3代基因編輯技術，由于其經濟、易操作，研究者們可以在其工作包中通過獲得更好的選擇而輕松地編輯感興趣的基因組等優點已成為科學界的研究熱點。雖然CRISPR/Cas9系統的優勢不言而喻，但它仍面臨著許多問題與挑戰。

CRISPR/Cas9系統的脫靶效應可能會是造成不良遺傳改變的原因，從而導致癌癥或其他棘手的問題，成為CRISPR/Cas9系統的瓶頸。雖然研究者們已經投入了很多努力改進對脫靶效應的預測和降低脫靶效應，但為了能更精確有效地編輯目標序列，需要研究者們開發更多的技術和算法。以往地研究認為，脫靶效應是一個不常見的現象，然而SCHAEFER等[24]的研究表明脫靶效應是廣泛存在的，盡管這個觀點對以往的結論提出了挑戰，但這不是CRISPR/Cas9系統的危機，相反，這是研究者在使用新技術時檢測脫靶效應的助力。

倫理問題是研究者在實際應用CRISPR/Cas9相關技術之前無法避免的問題。迄今為止，大多數國家都允許研究者編輯基因組，用于提高糧食產量其他生物用途。然而，關于操縱人類的卵子和精子等仍然非常具有爭議。首先，CRISPR/Cas9技術仍是一個尚不成熟的基因編輯技術，遺傳改造對后代的長期影響知之甚少，一旦發生錯誤或脫靶效應，將導致嚴重的后果。其次，CRISPR/Cas9技術可以編輯想要的任何基因組，如果將CRISPR/Cas9技術應用于反進化和反人類，將會帶來巨大的社會沖突。盡管存在分歧，但筆者樂觀地認為，研究者將會就這個問題與倫理學家和法律達成共識。

盡管CRISPR/Cas9系統仍然存在各種各樣的局限性和障礙，但相信將來隨著技術的逐漸成熟，能夠有助于藥物發現、癌癥治療及基因疾病的治愈。

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