血清樣本保存溫度和時(shí)間對胃泌素-17檢測結(jié)果的影響

麥 濤，唐義斌，王加強(qiáng)，張航烽，黃文芳(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072)

胃泌素是由胃竇和十二指腸黏膜G細(xì)胞分泌的多肽類激素，其中約90%為胃泌素-17(G-17)[1]。研究表明，G-17能夠反映胃黏膜狀態(tài)，當(dāng)胃黏膜發(fā)生病理變化時(shí)，血清 G-17含量也隨之發(fā)生改變[2，3]。因此，監(jiān)測血清G-17水平可間接反映胃部黏膜的形態(tài)和功能，起到胃黏膜“血清學(xué)活檢”的作用，目前已被日本、芬蘭、挪威等國用于胃癌和癌前病變的篩查[4]。在我國，作為胃功體檢項(xiàng)目在各個(gè)醫(yī)療體檢單位得到推廣應(yīng)用。但我國醫(yī)療資源配置分布不均，各醫(yī)療體檢單位所采集的胃功檢測樣本常需要送檢至第三方實(shí)驗(yàn)室。由此導(dǎo)致各個(gè)樣本存在不同的運(yùn)送時(shí)間、運(yùn)送溫度等情況。而這些因素很可能給G-17的檢測工作帶來較大的分析前誤差。目前血中G-17在不同溫度及保存時(shí)間下穩(wěn)定性的研究較少，有必要探討血清G-17標(biāo)本最適保存條件。鑒于臨床工作對標(biāo)本采集到整個(gè)檢測工作完成的時(shí)間要求一般在48小時(shí)內(nèi)完成，2017年3～4月作者就48小時(shí)內(nèi)G-17血清樣本保存時(shí)間和溫度對檢驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行分析并提出解決措施。

1 材料與方法

1.1樣本來源采取20名體檢者空腹10小時(shí)后血液樣本，室溫保存30分鐘待血清析出后，吸取并混合成一份樣本(以便消除個(gè)體潛在干擾因素的差異)，分裝，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按不同溫度(4、25、37 ℃)和保存時(shí)間(血清析出后0.5、2、4、24、48 h)進(jìn)行保存。

1.2儀器與試劑G-17檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購自芬蘭Biohit OYJ公司產(chǎn)品，使用艾迪康1100型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)臨床工作實(shí)踐及前期實(shí)驗(yàn)，G-17檢測分析前誤差中，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大的因素為樣本保存溫度、樣本保存時(shí)間，且兩者因素彼此之間可能存在交互影響。因此本實(shí)驗(yàn)考察這兩個(gè)因素，每個(gè)因素各取三個(gè)水平，選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。以G-17測定值為觀察指標(biāo)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測2次。考察兩者不同實(shí)驗(yàn)水平對G-17測定值的影響。鑒于考察的保存時(shí)間水平較多，充分利用正交實(shí)驗(yàn)高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢，根據(jù)保存時(shí)間設(shè)計(jì)2個(gè)不同正交實(shí)驗(yàn)即短期保存正交實(shí)驗(yàn)(表1)、長期保存正交實(shí)驗(yàn)(表2)。

1.4血清凍存對G-17檢測的影響將15份體檢者空腹10小時(shí)的血液抽取，血清充分析出后，分成三份。將其中一份血清常規(guī)檢測G-17，余下的兩份血清分別凍存24、48 h后檢測。

表1 G-17短期保存正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 G-17長期保存正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制血清G-17時(shí)間穩(wěn)定性曲線。就血清凍存前后所得G-17定量結(jié)果進(jìn)行單向方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1G-17不同溫度保存正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析將2項(xiàng)正交試驗(yàn)所得G-17的測定值依次輸入各自的正交試驗(yàn)表L9 (34)中，如表3、表4所示。計(jì)算出FA、FB和FA×B的F值，查F分布表得出F0.95(2，8)=4.46，F(xiàn)0.99(2，8) =8.65，F(xiàn)0.95(4，8)=3.84，F(xiàn)0.99(4，8)=7.01。方差分析結(jié)果如表5、表6所示。可知因素A、B對試驗(yàn)結(jié)果的影響是高度顯著的；兩者對G-17的穩(wěn)定性的影響存在顯著的交互作用，且A1×B1組合時(shí)測定值最高。SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析所得的直觀效應(yīng)圖(圖1)及G-17時(shí)間穩(wěn)定曲線(圖2)顯示，隨樣本保存溫度的上升、保存時(shí)間的延長，G-17降解程度越大。所檢測的三種保存溫度(4、25和37 ℃)下，根據(jù)其各自回歸曲線方程式，可計(jì)算出G-17降解10%所需時(shí)間分別為約20、4、2.5 h。因此，檢測G-17的樣本最優(yōu)保存方案是在4 ℃下保存，20 h內(nèi)及時(shí)檢測。

表3 短期正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 長期保存正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 短期正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

表6 長期正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2凍存前后G-17檢測結(jié)果比較不同凍存時(shí)間的G-17測定值與凍存前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，說明血清樣本凍存48 h內(nèi)對檢測結(jié)果無影響。見表7。

表7 -20 ℃凍存前后G-17測定值

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國居于第2 位，在全球位列第5 位[5，6]。有研究顯示我國年齡在40周歲以上人群，胃癌的患病率明顯增高，因此推薦40歲以上人群參與胃癌篩查[7]。目前胃癌的篩查手段有很多種如影像學(xué)技術(shù)、胃鏡及內(nèi)鏡下活組織病檢，但優(yōu)缺參半。因此操作簡單、經(jīng)濟(jì)、受檢者痛苦較小的胃功能血清標(biāo)志物如胃泌素G-17、胃蛋白酶原的定量檢測成為早癌篩查或診斷的重點(diǎn)工作。其檢測有助于胃癌的篩查，對胃癌有較高的特異性[8]。在臨床免疫檢查中，胃泌素在胃部疾病中的應(yīng)用與其血中檢測值緊密相關(guān)。2015年1月“中國早期胃癌篩查方案”上海國際研討會(huì)初步確定了胃鏡精查的血清學(xué)界值：PGⅠ≤70 μg/L，且PGⅠ/PGⅡ≤7.0，和G-17≤1 pmol/L，或G-17≥15 pmol/L，得到其他眾多專家的肯定。作者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)地區(qū)健康人群空腹血清中G-17濃度呈負(fù)偏態(tài)分布，其中位數(shù)為2.629 pmol/L，四分位數(shù)間距為2.172 pmol/L。因此，如檢測誤差較大，很容易出現(xiàn)測值低于1 pmol/L或15 pmol/L這兩個(gè)閾值的情況，從而導(dǎo)致誤診。所以減少G-17檢測的分析前誤差，得到準(zhǔn)確的實(shí)際值，對其應(yīng)用非常重要。

作者根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制了在4、25和37 ℃三個(gè)最常用的臨床工作溫度下G-17時(shí)間穩(wěn)定性曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析以及所繪制的曲線顯示出，G-17在離體后即開始降解。其降解速度表現(xiàn)為大致的拋物線型。但其降解速度在不同的保存溫度下表現(xiàn)不一致，即表現(xiàn)出隨保存溫度的下降而降解加快的規(guī)律。臨床實(shí)驗(yàn)檢測工作中，實(shí)驗(yàn)誤差難以避免，方法學(xué)存在允許誤差范圍。Tonks就方法學(xué)的醫(yī)學(xué)效能限度，提出最大允許范圍為其均數(shù)CV10%。對G-17檢測而言，作者認(rèn)為在血樣離體早期內(nèi)，G-17雖存在降解，但降解至其實(shí)際值90%內(nèi)，對萎縮性胃炎、胃癌等胃部疾病的篩查工作影響不大。該早期時(shí)段是臨床G-17檢測前的保存時(shí)長。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該保存時(shí)長受離體血清保存溫度影響，表現(xiàn)出隨保存溫度的上升而縮短的規(guī)律。在4 ℃時(shí)，其保存時(shí)長為約20小時(shí)，而在25 ℃和37 ℃時(shí)，則分別縮短為4小時(shí)、2.5小時(shí)左右。這表明，在臨床工作中，對于待檢測的G-17標(biāo)本必須盡快處理。如每個(gè)樣本血清析出后，放置于4 ℃環(huán)境下可保存20小時(shí)。否則根據(jù)所得出的G-17在不同溫度及保存時(shí)間的穩(wěn)定性規(guī)律，勢必導(dǎo)致胃病篩查假陽性率增高。

在實(shí)際工作中，難免會(huì)存在無法及時(shí)檢測的情況，需要凍存血清樣本。對此，我們就-20 ℃保存標(biāo)本較長時(shí)間是否會(huì)影響檢測結(jié)果進(jìn)行了配對設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，兩者的檢測結(jié)果無顯著性差異。因此，對于因各種原因所致無法及時(shí)檢測時(shí)，可以保存于-20 ℃較長時(shí)間。以便盡量減小分析前誤差。如將標(biāo)本外送至第三方醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測，最好采用-20 ℃冷鏈運(yùn)輸。

總之，根據(jù)G-17離體后時(shí)間穩(wěn)定性曲線，采用低溫保存，盡快檢測或者-20 ℃凍存是較好的降低分析前誤差的措施。

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