Box-Benhnken響應面法優化超聲輔助提取川續斷揮發油及GC-MS分析

李 濤， 蘇 趁

(四川大學 華西藥學院， 四川 成都 610041)

川續斷為川續斷科植物川續斷Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai的干燥根，能補肝腎、強筋骨、續折傷、止崩漏等，用于治療肝腎不足、腰膝酸軟、風濕痹痛、跌撲損傷、崩漏和胎漏[1].川續斷主產于我國湖北、湖南、江西、廣西、云南、貴州、四川和西藏等省區[2].現代研究表明川續斷揮發油對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌能力[3]，并對未孕或妊娠小鼠子宮具有顯著的抑制收縮作用，能抑制妊娠小鼠離體子宮的自發收縮頻率[4].水蒸氣蒸餾法是提取中藥揮發油的常用方法之一[5-9].現已報道的川續斷揮發油提取方法以乙醚為溶劑進行索氏提取，然后對乙醚提取物進行水蒸氣蒸餾，從而提取揮發油[3]；但此方法提取時間較長，且提取率較低.近年來，超聲輔助提取法已發展成為提取天然產物中活性成分的重要方法[10].超聲波輔助提取方法的操作簡單，能縮短提取時間，提高藥材成分的提取率，同時在提取過程中溫度升高不明顯，可抑制有效成分的揮發[11].目前，超聲輔助提取川續斷揮發油的研究未見報道.本研究采用Box-Benhnken響應面法設計優化超聲輔助提取川續斷揮發油的最佳工藝參數，回歸擬合方程預測模型能對川續斷揮發油的超聲提取效果進行有效預測和分析，并利用GC-MS分析方法對川續斷揮發油化學成分進行解析鑒定，為川續斷揮發油的藥用研究和開發利用奠定基礎.

1 材料與儀器

1.1藥材與試劑川續斷采自云南省大理州彌渡縣，石油醚、無水NaSO4均為分析純(成都天華化工科技有限公司).

1.2儀器QP2010Plus型氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津)，瑞士MettlerToledo公司AB104-N型電子分析天平，KQ-100DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，R201D-Ⅱ旋轉蒸發器(上海申順生物科技有限公司)，SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)，GZX-DH-40X45電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械廠)，W201D恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司).

2 實驗方法

2.1川續斷揮發油提取將干燥后的藥材粉碎，過40目篩，再置干燥箱中烘干至恒重.準確稱取10g藥材粉末于具塞錐形瓶中，加入一定料液比的石油醚，密塞，超聲提取一定時間，在提取液中加入無水Na2SO4，進行抽濾，濾液倒入已知質量為m1的圓底燒瓶中，然后在35 ℃水浴鍋中減壓濃縮至干，稱其質量為m2.

揮發油提取率(%)=(m2-m1)/10×100%.

2.2單因素試驗

2.2.1超聲功率 本文料的單位為g，溶液的單位為mL，以石油醚為提取劑，在料液比1∶15，超聲時間30min條件下，設置超聲功率分別為60、70、80、90、100W等5個水平，每個水平進行3次平行實驗，計算每個水平下揮發油平均得油率.

2.2.2超聲時間 以石油醚為提取劑，超聲功率為2.2.1中最優水平，料液比為1∶15，設置超聲時間分別為10、20、30、40、50min等5個水平，每個水平進行3次平行實驗，計算每個水平下揮發油平均得油率.

2.2.3料液比 以石油醚為提取劑，超聲功率為2.2.1中最優水平，超聲時間為2.2.2中最優水平，設置料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 等5個水平，每個水平進行3次平行實驗，計算每個水平下揮發油平均得油率.

2.3Box-Benhnken響應面法試驗根據2.2中單因素實驗結果，利用Design-Expert8.0.6Trial軟件設計超聲功率(A)、料液比(B)、超聲時間(C)等3因素3水平的Box-Benhnken試驗，以得油率為響應值.試驗設計見表1.

表 1 響應面分析因素及水平表

2.4GC-MS分析氣相色譜條件：色譜柱：Rxi-5m彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣：氦氣；進樣溫度：290 ℃；柱箱溫度(采用程序升溫方案)：柱初始溫度為50 ℃，保持5min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2min，再以5 ℃/min升至290 ℃，保持10min；進樣量：1μL；分流比：10∶1；柱流量：1.0mL/min；溶劑延遲時間：3min.

質譜條件：離子源：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：220 ℃；檢測電壓：0.8kV；質量掃描范圍(m/z)：33～700amu；電子能量：70eV.

3 結果與分析

3.1單因素實驗

3.1.1超聲功率的影響 在超聲功率60、70、80、90、100W水平下揮發油平均得油率分別為：1.365%、1.521%、1.868%、1.777%、1.661%.超聲波是通過空化效應破碎細胞，從而提取細胞內的揮發油.當超聲功率達到一定值時，產生的空化現象使氣泡閉合過快，產生的沖擊波不能使川續斷細胞完全破碎，從而導致得油率下降[12].因此，進行響應曲面分析試驗時，超聲功率以80W為中心值.隨著超聲功率的增大，川續斷的得油率不斷升高，當超聲功率為80W時，此時得油率達到最大值，隨著超聲功率繼續增大，得油率略有降低.

3.1.2料液比的影響 在料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25水平下揮發油平均得油率分別為:1.251%、1.356%、1.851%、1.799%、1.8%.當料液比為1∶15時，川續斷揮發油得油率達到最大值.料液比小于1∶15時，隨著料液比的增大，得油率也隨之上升.當料液比達到1∶15時，得油率基本持平，隨著溶劑劑量的增加，得油率幾乎保持穩定.從節約溶劑的方面考慮，進行響應曲面分析試驗時，料液比以1∶15為中心值.

3.1.3超聲時間的影響 在超聲時間10、20、30、40、50min水平下揮發油平均得油率分別為：1.431%、1.46%、1.836%、1.709%、1.65%.當超聲時間達到30min時，此時得油率達到最大值，隨著超聲時間的繼續延長，得油率稍微下降.推斷其原因為隨著超聲時間的延長，導致部分揮發油結構遭到破壞，從而使部分揮發油成分發生降解，使得川續斷揮發油提取率降低.因此，進行響應曲面分析試驗時，超聲時間以30min為中心值.

3.2響應面優化試驗

3.2.1響應面設計方案 根據Design-Expert8.0.6Trial軟件中Box-Behnken設計響應曲面試驗,以A、B、C等3個因素為變量，以得油率為響應值，實驗設計和結果見表2.

3.2.2響應面法試驗結果分析 根據Design-Expert8.0.6Trial軟件分析數據得回歸擬合方程

得油率=-13.642+0.316×A+0.239×B+
0.080×C+2.39×10-3×AB-4.45×10-4×
AC+2.50×10-4×BC-2.16×10-3×A2-
0.014 3×B2-7.42×10-4×C2.

試驗結果顯著性和方差分析見表3,該模型F=121.54，P<0.000 1，可知該二次回歸擬合方程模型極顯著.該模型中A、B、C、AB、A2、B2、C2項是極顯著(P<0.01)，AC項是顯著(P<0.05)，BC項是不顯著(P<0.1).通過F值分析，3因素對得油率的影響大小依次為：A(F=44.76)>B(F=22.32)>C(F=13.46).失擬項值為6.52，P=0.050 9>0.05，表明失擬項不顯著，實驗誤差較小，因此該模型能對川續斷揮發油的超聲提取效果進行有效預測和分析.

表 2 Box-Benhnken響應面實驗設計和結果

表 3 試驗結果顯著性和方差分析表

注： **表示影響極顯著(P<0.01)， *表示影響顯著(P<0.05)，P<0.1是不顯著項.

實驗數據做概率與預測分析，如圖1和圖2所示.圖1數據點幾乎分布在一條直線上，符合對殘差正態概率的要求；圖2中數據點分布雜亂無章、無規律，符合殘差與預測值的要求，說明該組實驗數據正常，可以反映實驗的真實性.從表4知，模型的相關系數R2=0.993 6，表明該模型有較好擬合度；修正R2=0.985 5，表明該模型可以解釋98.55%的實驗數據變異性；預測R2= 0.913 8，與R2、修正R2相差不大，表明該模型預測值與實測值符合良好，模型具有代表性.得油率的平均值(δMean)為1.53，標準偏差(σ)和變異系數(C×V)均表示數據的離散程度：

圖 1 殘差的正態概率分布圖

項目參數項目參數σ0029R209936δMean153修正R209855C·V190預測R209138

C·V=(σ/δMean)× 100%，

C·V<15，表示實驗數據正常.

以得油率為響應值作響應曲面圖，如圖3～5所示，并分析各個因素間的顯著性和交互作用.從圖3可知，當超聲時間固定在零水平時，超聲功率和料液比的響應曲面最陡，說明兩者對川續斷揮發油提取率影響最顯著，且成二次線性關系；底部等高線呈橢圓且閉合，說明兩者交互作用顯著，且有最高點.從圖4可知，當超聲功率固定在零水平時，料液比響應曲面較陡，但是超聲時間響應曲面比較緩和，幾乎成一條直線，說明料液比對川續斷揮發油提取率更顯著，且成二次線性關系，但是超聲時間對川續斷揮發油提取率影響顯著性較差，幾乎呈一次線性關系.從圖5可知，當料液比固定在零水平時，超聲功率響應面較陡，但是超聲時間響應曲面比較緩和，相比較來說超聲功率對川續斷揮發油提取率影響更顯著.通過響應曲面圖分析可知3個因素對川續斷揮發油提取率影響性大小為：A>B>C.

圖 3 超聲功率和料液比對川續斷揮發油得油率響應曲面和等高線

圖 4 料液比和超聲時間對川續斷揮發油得油率響應曲面和等高線

圖 5 超聲功率和超聲時間對川續斷揮發油得油率響應曲面和等高線

通過Design-Expert 8.0.6 Trial軟件分析可確定最佳工藝條件為：超聲功率78.19 W,料液比1∶15.22,超聲時間33.16 min，得油率預測值為1.846%.

3.2.3模型驗證 針對實際可操作性，工藝條件修改為：超聲功率80W,料液比1∶15,超聲時間33min.在此條件下，通過3次平行實驗進行驗證，平均得油率實測值為1.869%，與預測值基本一致(預測值與實測值對比如圖6所示).從圖6可見，數據點基本上處于一條直線上，擬合方程模型的預測值與實測值差異較小，可以用于揮發油得油率預測.因此，結果表明該擬合方程模型的預測值與實測值符合良好，能有效的預測川續斷揮發油得油率，對川續斷揮發油的提取和優化具有指導意義.

圖 6 預測值與實測值對比圖

3.3GC-MS分析按本文2.4的條件和方法對川續斷揮發油成分進行GC-MS分析，得到揮發油成分的總離子流圖，計算機通過峰面積歸一化法對總離子流圖進行解析，共檢測出53種成分，通過質譜譜庫NIST08.LIB檢索以及人工圖譜解析鑒定了51種化合物(表5).川續斷揮發油中峰面積百分比最高的物質為γ-谷甾醇(35.80%)，其次為豆甾醇(8.37%)、24-甲基-5-膽甾烯-3-醇(7.06%)、羊毛甾醇(6.71%)、正十五酸(3.23%)、正四十四烷(3.13%)、4α,14-二甲基-9β,19-環-5α-麥角甾-24(28)-烯-3β-醇乙酸酯(3.00%)、4-膽甾烯-3β-醇(2.29%)、羽扁豆醇(2.27%)、四十三烷(2.10%)、Z-7-十四碳烯醛(2.09%)、熊果-12-烯-28-醛(2.07%)、11,14-二十碳二烯酸甲酯(1.96%)、正二十一烷(1.96%)、2,6,10,15-四甲基十七烷(1.92%)、11-癸基二十四烷(1.74%)、溴化金合歡酯(1.62%)、1-氯二十七烷(1.11%)、1-氯二十碳烷(1.08%).

續表5

峰號保留時間/min名稱分子式相對分子質量峰面積百分比/%3440215法呢醇C15H26O2220763541178正四十四烷C44H906183133642874正二十一烷C21H442961963744853四十三烷C43H886042103845044棕櫚酸-3-溴-2-丙炔酯C19H33BrO23720933945512膽甾烯基豆蔻酸酯C41H72O259607440472031-氯二十七烷C27H55Cl414111414879724-甲基-5-膽甾烯-3-醇C28H48O4007064249699豆甾醇C29H48O41283743499981-碘四十八烷C48H97I8000814451493γ-谷甾醇C29H50O41435804551951溴化金合歡酯C15H25Br28416246523494α，14-二甲基-9β，19-環-5α-麥角甾-24(28)-烯-3β-醇乙酸酯C32H52O246830047527881-氯二十碳烷C20H41Cl3161084853693羊毛甾醇C30H50O42667149551484-膽甾烯-3β-醇C32H52O24682295056321羽扁豆醇C30H50O4262275161751熊果-12-烯-28-醛C30H48O424207

4 結論

本研究采用Box-Benhnken響應面法設計優化超聲輔助提取川續斷揮發油的最佳工藝參數，回歸擬合方程預測模型能對川續斷揮發油的超聲提取效果進行有效預測和分析，超聲輔助提取川續斷揮發油的最佳工藝參數為：超聲功率80 W,料液比1∶15,超聲時間33 min.模型驗證實驗平均得油率實測值為1.869%，與預測值1.846%基本一致，表明該實驗方法具有可行性，分析結果可靠，為川續斷揮發油工業化提取提供理論依據.

通過GC-MS分析超聲輔助提取得到的揮發油，共檢測到53種成分，并鑒定出51種化合物，鑒定率為96.23%.其中醇類的相對含量最大，烴類物質種類最多，相對含量較大的化學成分是γ-谷甾醇(35.80%)，其次為豆甾醇(8.37%)、24-甲基-5-膽甾烯-3-醇(7.06%)、羊毛甾醇(6.71%)等.其中，γ-谷甾醇是β-谷甾醇的C24位異構體，具有降血糖作用和抗癌活性[13]；豆甾醇具有抗腫瘤、降低血液膽固醇、抗氧化、抗炎和對學習記憶的改善等藥理作用[14]；羊毛甾醇可以逆轉晶狀體內蛋白質的聚集，減輕白內障的嚴重程度，提高晶狀體的清晰度[15].

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