微小RNA經Wnt通路調控成骨分化及其力學響應的研究進展

鄢志雄 綜述，汪 洋，郭 勇 審校

(桂林醫學院生物技術學院，廣西桂林 541004)

微小RNA(miRNA)是一類長度約22 nt的內源性非編碼RNA，主要通過識別靶基因mRNA和靶基因mRNA的非編碼區堿基配對，引導沉默復合體降解mRNA或阻礙其翻譯，在轉錄后水平負調控基因的表達[1]。miRNA在干細胞分化、增殖和新陳代謝中，起著關鍵調節作用[2]。Wnt信號通路是一個蛋白質相互作用的復雜網絡，為生物生長發育所必需[3-4]。Wnt信號傳導路徑較多，據信號轉導途徑的不同，將Wnt信號通路分為經由β-catenin的經典Wnt/β-catenin信號通路、調控細胞平面極性的Wnt/PCP(planner cell polarity pathway)信號通路和調控細胞內鈣信號的Wnt/Ca2+信號通路[3]。后兩種被稱為非經典Wnt信號通路。近年來，研究證明Wnt信號通路在干細胞的成骨分化和骨量維持上起著重要作用[4]。

力學載荷是控制骨重建的一個重要因素，適量的力學載荷能保持骨形態和功能的穩定[5]。有報道顯示機械刺激能通過Wnt信號通路途徑影響干細胞的成骨分化[6-7]。近年來大量研究都集中在機械應力刺激下干細胞成骨分化的分子機制方向[8-10]。然而，力學轉導的確切機制尚未研究清楚。Wnt信號通路可能在機械刺激下的干細胞成骨分化信號傳導過程中有重要地位，而與Wnt信號通路相關的miRNA也具有巨大的研究價值。本文就miRNA通過Wnt信號通路調控成骨分化的分子機制及力學載荷對此過程的影響方面的研究現狀及新進展做一綜述。

1 miRNA在干細胞成骨分化中的調控作用

干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，其成骨分化是眾多基因程序性表達及精細調控的結果。miRNA作為一種轉錄后調控因子，它通過調節靶基因mRNA的表達，來調控分化過程中多種相關因子和受體，從而完成對干細胞成骨分化的精確調控。近年來大量研究表明，miRNAs對成骨分化上游信號(如骨形態發生蛋白，即bone morphogenetic protein，BMP)、成骨分化重要信號通路(如Wnt信號通路)及成骨分化下游標志性基因(如Runt相關轉錄因子2，Runx2)等都有調控作用[11-13]。

1.1miRNAs與成骨分化上游信號 轉錄因子Dlx在干細胞成骨分化中發揮重要作用。QADIR等[14]在研究中發現，BMP-2介導的成骨分化過程中，人和小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)中miR-124的表達與對照組相比約降低50%，而Dlx5、Dlx3和Dlx2的RNA和蛋白水平均數倍高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；另外，通過抑制miR-124的表達，結果表明Dlx基因的mRNA和蛋白的表達量均增加；且熒光素酶等相關報告基因分析表明，miR-124直接靶向Dlx3、Dlx5和Dlx2的3′-UTR。因此，miR-124通過作用于轉錄因子Dlx的3′-UTR，導致其mRNA的降解或翻譯阻遏，抑制骨的形成。

1.2miRNA與成骨分化下游標志性基因 LI等[15]在研究小鼠BMSCs成骨分化時發現，在BMP-2誘導的成骨分化過程中，miR-2861通過抑制組蛋白脫乙酰基酶5(histone deacetylase5，HDAC5)的表達，抑制Runx2降解，從而促進骨形成。而在進一步實驗中發現，原發性骨質疏松癥患者體內premiR-2861純合子發生突變，miR-2861表達量明顯下調，且HDAC5表達異常升高；而小鼠BMSCs實驗中，HDAC5表達增高的同時，Runx2表達降低，成骨分化作用受到抑制。因此，該研究結果提示miR-2861的異常表達作用于Runx2抑制成骨分化，并且與原發性骨質疏松癥的發生關系密切。XU等[16]研究了人BMSCs成骨分化過程中的某些miRNAs的功能，通過驗證發現其中miR-885-5p通過抑制Runx2及相關成骨基因的表達來調控成骨分化。

1.3miRNA經Wnt信號通路在成骨分化中的調控作用 Wnt信號通路分為經典Wnt/β-catenin信號通路和非經典Wnt信號通路。經典信號通路是由胞外的Wnt蛋白與膜上的相應受體蛋白，Frizzled家族蛋白(frizzled proteins，Fz)和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL receptor related protein，LRP)復合物結合，激活胞內的散亂蛋白(dishevelled，Dsh或Dvl)，誘導胞內的四聚體[APC蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、Axin支架蛋白、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、β-catenin]分解，使胞內β-catenin的降解途徑無法進行，β-catenin濃度升高，進入核內與轉錄因子(TCF/LEF)結合，最終誘導成骨相關靶基因的表達，調控成骨分化[17]。非經典Wnt信號傳導通路中，Wnt蛋白(主要包括Wnt5a、Wnt7a、Wnt11等)與Fz和LRP5/6結合引起相應非經典Wnt信號的激活[18]。miRNA對Wnt信號通路的調控分為3個部分：(1)miRNA可作用于細胞外和細胞內各種Wnt信號通路拮抗物[如Dickkopf相關蛋白(DKKs)、frizzled相關蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)等]的mRNA；(2)miRNA通過影響膜蛋白與受體結合及作用于四聚體(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)的各成分，影響胞內的四聚體的合成，調控成骨相關基因的表達。(3)miRNA還可通過非經典Wnt信號通路中的相關因子來調控成骨分化過程。

1.3.1miRNA與細胞外和細胞內的各種Wnt信號通路拮抗物 HASSAN等[19]研究人脂肪間充質干細胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)的成骨分化過程時發現，體外培養的hADSCs在成骨分化過程中內源性miR-218表達上調；增加外源性的miR-218促進其成骨分化，而下調miR-218的表達可抑制其成骨分化。經過對miR-218作用靶點的探究發現，miR-218直接作用靶點為SFRP2和DKK2(Wnt信號通路上游的抑制因子)，miR-218可解除SFRP2或DKK2對Wnt信號通路的抑制作用，從而激活Wnt/β-catenin信號通路；另外，模擬Wnt信號通路的激活或阻斷Wnt信號通路，hADSCs內相應的miR-218的表達水平隨之增加或減少。因此，該課題組推測miR-218與經典Wnt信號通路對干細胞成骨分化的調控是一種反饋調節過程。KAPINAS等[20]研究發現，高表達的miR-29a/c對Wnt/β-catenin信號通路的抑制因子DKK1(Wnt信號通路的上游抑制因子)產生直接抑制效應，使Wnt/β-catenin信號通路激活；另一方面，miR-29a/c又以骨黏蛋白為直接抑制對象，在成骨分化晚期抑制骨黏蛋白的表達水平，抑制成骨分化。

1.3.2miRNA與膜蛋白及胞內的四聚體 LI等[21]研究結果表明，miR-23a在成骨分化的過程中明顯下調。過表達或下調miR-23a，體外hBMSCs的成骨分化受到相應抑制或促進。進一步實驗證明，LRP5(Wnt蛋白的細胞膜受體蛋白)是miR-23a直接作用靶點，敲除LRP5可以抑制hBMSCs的成骨分化，與上調miR-23a的結果相一致。因此證實了miR-23a在的成骨分化中通過靶向LRP5，導致Wnt蛋白無法與受體結合，Wnt信號通路受到抑制，導致hBMSCs的成骨分化受到抑制。MENG等[22]發現上調miR-21可提高人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)中成骨分化相關基因的表達水平，促進GSK-3β(Wnt信號通路中四聚體的成分之一)的磷酸化，使GSK-3β趨于穩定，細胞中β-catenin的積累增多，激活轉錄過程，促進成骨分化。這表明miR-21通過間接調節Wnt信號通路中的GSK-3β，來調控干細胞成骨分化過程。WANG等[23]探究hADSCs發現miR-26a通過直接靶向GSK-3β，抑制GSK-3β蛋白的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路從而促進hADSCs的成骨分化。WANG等[24]研究hBMSCs的成骨分化過程的調控機制，發現炎癥因子TNF-α可誘導轉錄因子NF-κB的激活，使miR-150-3p的表達上調，而miR-150-3p可與β-catenin mRNA的3′-UTR結合，降低細胞內β-catenin的水平，抑制hBMSCs的成骨分化。

1.3.3miRNA與非經典Wnt信號通路 LI等[25]研究小鼠脂肪源性間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)成骨細胞分化時，發現過表達的miR-26a-5p抑制成骨分化，而抑制內源性miR-26a-5p的表達可促進成骨分化。鈣離子熒光探針和Western blot分析顯示，mir-26a-5p抑制Wnt5a、蛋白激酶C(Wnt/Ca2+信號通路的相關因子)的表達及鈣離子內流，從而抑制小鼠ADSCs的成骨分化。進一步研究發現，上調的miR-26a-5p通過靶向Wnt5a，抑制非經典Wnt信號傳導通路Wnt/Ca2+信號通路，抑制ADSCs成骨分化。

盡管眾多研究顯示miRNA通過Wnt信號通路調節干細胞成骨分化，但鮮有研究從miRNA的視角出發探討機械刺激的生物信號轉導過程中干細胞成骨分化機制。

2 力學響應miRNA對干細胞成骨分化的影響

2.1成骨分化中的力學響應miRNA 力學刺激是細胞受到的最基礎的刺激之一。近年來，研究發現力學因素對干細胞增殖和成骨分化起著重要的調節作用[26]。同時，發現一些在力學載荷作用下差異表達的miRNA，被稱之為力學響應miRNA，可以響應力學刺激、調節細胞的增殖與成骨分化。其中大部分miRNA調控成骨分化的作用靶點未得到驗證，另外有一小部分miRNA作用靶點已被驗證[27]。文獻[28]報道，對體外培養小鼠MC3T3-E1成骨細胞施加 12 dyn/cm2、1 h/d的周期性剪切應力刺激，基因芯片和實時熒光定量PCR檢測到miR-20a、miR-21、miR-19b、miR-34a、miR-34c、miR-140和miR-200b明顯下調，推測12 dyn/cm2、1 h/d的流體剪切應力可以促進成骨分化并且這些明顯下調的miRNA可能參與成骨分化的調控。本課題組對體外培養小鼠MC3T3-E1成骨細胞施加2 500 με、0.5 Hz不同時長的張應變力學刺激，利用基因芯片和實時熒光定量PCR檢測發現miR-218、miR-191、miR-3070a和miR-33的表達具有明顯差異，表明這4種miRNAs可能是成骨分化過程中響應力學載荷的潛在調節因子[29]。WANG等[30]對MC3T3-E1細胞施加微重力和10 dyn/cm2、1 h/d流體剪切力這兩種不同類型的力學載荷刺激誘導成骨分化，作用過后，通過RT-PCR檢測發現受力前后miR-33-5p證實，Hmga2基因是miR-33-5p的靶基因，可抑制MC3T3-E1細胞的成骨分化。這表明miR-33-5p是一種力學響應miRNA，參與調控MC3T3-E1細胞在力學環境改變誘導下的成骨分化過程。

2.2力學刺激經Wnt信號通路影響成骨分化 有研究證明，機械刺激可通過Wnt信號通路影響干細胞向成骨細胞分化。SHI等[31]對大鼠肌腱干細胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)施加2%幅度、正弦波型、0.5 Hz、4 h/d的張應力刺激，發現TDSCs向成骨方向分化。用Ras同源基因家族成員A(ras homolog gene family member A，RhoA)的抑制劑下調RhoA的表達，抑制了張應力刺激下TDSCs的成骨分化；進一步研究發現，張應力刺激使TDSCs中的Wnt5a的mRNA水平增加。用小干擾RNA抑制Wnt5a的表達抑制了張應力刺激下TDSCs的成骨分化，而RhoA活化劑可使此過程恢復。因此，張應力刺激通過非經典Wnt/PCP(Wnt5a-RhoA)信號通路促進TDSCs的成骨分化。ZHANG等[32]發現給牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)施加100 kpa的靜態壓力，可使Wnt/β-catenin信號通路激活，從而調節PDLSCs成骨分化。DU等[33]證明0.5 Hz、2 000 με、2 h/d張應力刺激可激活Wnt/β-catenin信號通路和Wnt/Ca2+信號通路，促進hADSCs成骨分化。以上研究均證明機械刺激對干細胞的成骨分化作用與Wnt信號通路關系密切。

2.3力學響應miRNA經Wnt信號通路影響成骨分化 LI等[34]對體外培養的小鼠ADSCs施加0.5 Hz、2 000 με、2 h/d周期性張應力刺激，從miRNA的角度出發探討在力學刺激作用下ADSCs成骨分化的力學傳導機制。芯片結果顯示ADSCs在張應力刺激下內源性miR-154-5p顯著下調。熒光素酶報告基因分析證明Wnt11的3′-UTR是miR-154-5p的直接靶點。在力學刺激作用下，上調miR-154-5p的表達，結果顯示ADSCs的成骨分化受到抑制；下調miR-154-5p的表達，可明顯促進ADSCs的成骨分化。進一步的實驗證明，miR-154-5p的過表達通過與Wnt11的mRNA的3′-UTR結合抑制其轉錄，降低Wnt11蛋白的濃度，從而抑制非經典Wnt/PCP(RhoA-ROCK)信號通路的激活，ADSCs的成骨分化也受到抑制；ADSCs的miR-154-5p下調后，可激活Wnt/PCP(RhoA-ROCK)信號通路，促進ADSCs的成骨分化。簡言之，周期性張應力刺激下，miR-154-5p響應力學刺激，經Wnt/PCP信號通路靶向Wnt11調節ADSCs的成骨分化。

3 小結與展望

近年來，Wnt信號通路已漸漸為人們所重視，人類某些骨疾病，如骨質疏松癥、硬化性骨化病，已證實與異常的Wnt信號通路相關[35-36]。這些發現需要研究者們對疾病的發病機制與Wnt信號通路在干細胞成骨分化的分子機制和調控機制進行更深層次的探索，以尋求治療疾病的新思路和新方法。通過對特異性表達的miRNA的不斷發現和靶點的驗證，可能尋找到診斷骨疾病的新方法。另外，力學載荷是骨組織受到的最基本的刺激之一，在干細胞向成骨定向分化的過程中起關鍵的調節作用。研究miRNA影響干細胞成骨分化的途徑及其調控機制離不開力學的環境。然而，現階段對力學載荷作用下成骨分化過程中特異性表達的miRNA的研究尚處于起步階段，許多與干細胞成骨分化相關的力學響應miRNA的作用靶點和調控機制并未得到驗證，明確力學響應miRNAs的功能、調控機理、作用靶點、激活抑制因素及不同miRNA之間的相互作用和聯系將是今后研究的重點。

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