鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC檢測

鐘運超,黃靜靜,張騫予,張 康

(廣西壯族自治區梧州市人民醫院/右江民族醫學院附屬梧州醫院腫瘤科，廣西梧州 543000)

鼻咽癌是東南亞最常見的頭頸部惡性腫瘤，放射治療是其主要的治療手段。鼻咽癌在臨床確診時70%以上是中晚期。但中晚期的鼻咽癌5年生存率仍低。主要失敗的原因是局部復發和遠處轉移。免疫治療在降低復發和遠處轉移方面有獨到的優勢。目前，免疫治療已成為惡性腫瘤新的治療方法。而免疫治療主要集中在免疫逃逸的研究。髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)可以通過多種機制介導腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤的發生、發展。因此MDSC是繼調節性T細胞之后的另外一個備受關注的細胞，是一群缺乏淋巴細胞標志，未分化完全的骨髓源性異質性細胞群，是樹突狀細胞，巨噬細胞和(或)粒細胞前體。MDSC在人外周血的分子標志為HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+。MDSC在鼻咽癌領域研究較少。為進一步了解MDSC在鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例情況，本研究對45例鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC進行了檢測，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2015年7月在本院住院的45例鼻咽癌患者，其中男23例，女22例，年齡60～65歲(平均62.5歲)。均經病理組織確診(鼻咽角化癌8例，鼻咽分化型非角化癌14例，未分化型非角化癌23例)。按照國際抗癌聯盟2009年分期標準進行分期，其中Ⅱ期10例、Ⅲ期15例、Ⅳ期20例。全部病例均在放療前均接受了2周的奈達鉑聯合5-FU(NF方案)的誘導化療。全部病例均在第1次化療前及第2周期誘導化結束后7 d抽取患者外周血，同時簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準。另外抽取20例健康志愿者的外周血作為健康對照組。所有研究對象既往無腫瘤和系統疾病病史，臟器功能基本正常，無伴有嚴重并發癥等。

1.2流式細胞儀檢測HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC的表達水平

1.2.1試劑與儀器 CD11b FITC(美國BD公司)，CD33PE(美國BD公司)，CD14 FITC(美國BD公司)，HLA-DR -APC(美國BD公司)，FACSTM Permeabilizing Solution2(10×)，購自美國BD公司，BD FACSTM lysing Solution(10×)，購自美國BD公司，PBS由博士德生物工程有限公司生產，臺式離心機 Labofuge 400R Thermo Fisher產品；BD FACSCalibur 流式細胞儀(BECTON DICKNSON)，漩渦混均儀(VORTEX-GENIE)。

1.2.2檢測方法 依據實驗Panel為樣本管編號，將待用抗體置于冰盒上備用。在試管中按Panel加入試劑規格要求的膜表面抗體；根據細胞計數結果加入適量的樣本量；低速混勻3 s，室溫孵育20 min；向每個試管中加入紅細胞裂解液2 mL,混勻，在室溫避光10 min；溫育后立即在室溫離心1 500 r/min，5 min；棄上清液，加2 mL PBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1 500 r/min，5 min，倒掉上清液；加入1 mL破膜劑室溫避光10 min，室溫離心1 500 r/min，5 min,棄上清液；加2 mL PBS洗滌，低速混勻3 s，室溫離心1 500 r/min，5 min，棄上清液；加入細胞內標記抗體，低速混勻3 s，室溫孵育30 min；向試管中加2 mL PBS重懸，低速混勻3 s，室溫離心1 000 r/min，5 min，倒掉上清液；最后加入0.5 mL含1%多聚甲醛PBS重懸，上機檢測。

2 結 果

2.1鼻咽癌患者與健康對照組人群外周血MDSC的分布情況 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者外周血和健康對照組人群外周血均存在MDSC，分別是(0.89±0.22)%、(1.19±0.20)%、(1.58±0.39)%和(0.20±0.02)%，鼻咽癌患者外周血存在MDSC比例明顯高于健康對照組人群(F=104.92,P<0.05)。而且隨著Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的升高，鼻咽癌患者外周血MDSC比例也逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2不同病理類型的鼻咽癌患者外周血MDSC分布情況 本研究檢測了鼻咽角化癌、鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種不同病理類型患者外周血MDSC分布，結果顯示：鼻咽角化癌、鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種不同病理類型鼻咽癌患者外周血MDSC比例分別是(0.85±0.23)%、(1.21±0.20)%、(1.46±0.44)%，均高于對照組人群的比例(0.20±0.02)%(F=71.82，P<0.05)。3種不同病理類型的鼻咽癌患者外周血MDSC比例也有差異(P<0.05)，其中以未分化型非角化癌表達最高，達(1.46±0.44)%。

2.3NF方案誘導化療前后鼻咽癌患者外周血MDSC分布比例 經過2個周期化療后，各期患者外周血的MDSC比例均有顯著降低，其中Ⅱ期化療前(0.89±0.22)%、化療后(0.41±0.24)%(F=5.89，P<0.05)，Ⅲ期化療前(1.19±0.20)%、化療后(0.53±0.21)%(F=9.65，P<0.05)，Ⅳ期化療前(1.58±0.39)%、化療后(0.99±0.31)%(F=7.72，P<0.05)。但其表達水平仍然高于健康對照組人群。

3 討 論

鼻咽癌是東南亞最常見的頭頸部惡性腫瘤，以廣東、廣西高發。放射治療是其主要的治療手段。但復發和轉移仍然是鼻咽癌的主要死因。研究表明：腫瘤的發生、發展與機體免疫監視，免疫耐受，免疫逃逸和免疫無能等免疫紊亂有關。免疫耐受的持續存在，引起突變的細胞對宿主體內的免疫監視功能的無反應性，出現腫瘤逃逸，與其有關的主要是CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)細胞，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和髓源性抑制細胞(MDSC)等3種免疫抑制細胞。其中MDSC是一群髓源祖細胞中具有免疫抑制功能的細胞，健康人體內的含量很低，不會發生免疫抑制；但在燒傷，自身免疫疾病，急性或慢性感染等病理狀態下，血清中MDSC比例會顯著上升，進而發揮免疫抑制作用。而且是處于不同分化階段對腫瘤具有免疫抑制作用的異質性細胞群。在人類細胞中分子標志主要表達CD11b+CD33+但缺乏CD14-和HLA-DR-[1]。在腫瘤微環境中MDSC可以誘導局部免疫耐受[2]，其免疫耐受不僅與腫瘤細胞本身因素如腫瘤抗原調變、MHC分子、共刺激分子表達降低有關，也與腫瘤引起的機體免疫功能異常關系密切。主要通過以下幾種機制誘導腫瘤抗原特異性的細胞免疫耐受，包括釋放轉化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素(IL)-10等細胞因子誘導調節T細胞(Treg)，Ⅱ型巨噬細胞的產生間接抑制T細胞增殖和活性；清除半胱氨酸可以抑制正常APC對T細胞的激活；通過產生活性氧，一氧化氮合成酶和精氨酸酶抑制T細胞增殖，促進T細胞凋亡；產生膜結合型TGF-β以直接方式抑制T細胞活性等[3]。另外MDSC還可以在腫瘤部位分化成調節性DC，后者引起的T細胞分泌IFN-r能力下降[4]。而抑制或殺傷腫瘤誘導的MDSC可以提高T細胞功能[5]。大量研究表明：鼻咽癌患者出現一系列免疫功能紊亂，造成機體對微生物及其毒素的反應發生異常改變，免疫異常對鼻咽癌細胞的種植、黏附、增生具有直接或間接作用，從而誘發鼻咽癌的不斷發展與惡化。 鼻咽癌患者外周血的MDSC通過在數量上的增加等因素發揮免疫抑制效應[6]。研究報道在荷瘤小鼠和腫瘤患者的外周血中可以檢測到MDSC細胞明顯升高，并且具有很強的免疫抑制作用[7-8]。而健康者則不具有或僅有很弱的免疫抑制作用。 腫瘤患者外周血MDSC比例顯著高于健康人群，其MDSC數量與腫瘤分期呈正相關[9]，其遠處轉移也與腫瘤患者外周血MDSC數量顯著增加有關[10-11]，從而直接參與腫瘤免疫逃逸和遠處轉移。 本研究發現鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC比例明顯高于健康對照人群的HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+MDSC比例(P<0.05)；隨分期的上升而明顯增多(P<0.05)，與文獻[12]報道相似?？赡芤驗槟[瘤源性因子(TDFs)通過STATS信號途徑促進MDSC的募集和擴增有關。提示這群細胞在鼻咽癌的發生、發展中起一定作用，可以用于判斷病情，協助臨床分期。進一步對鼻咽角化癌，鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種類型的MDSC比例進行分析，發現鼻咽角化癌，鼻咽分化型非角化癌和未分化型非角化癌3種類型患者外周血MDSC比例均高于健康對照組人群(P<0.05)。值得注意的是，在3種不同病理類型之間，其外周血MDSC比例也存在差異(P<0.05)，其中以未分化型非角化癌表達最高達(1.46±0.44)%。說明腫瘤分化程度越低，外周血中MDSC比例增高越明顯。與文獻[13-14]報道基本一致。提示其對判斷患者預后具有一定意義。本研究也發現化療在一定程度上能降低MDSC水平，兩個周期NF方案化療前后比較有顯著差異(P<0.05)，但其結果仍然比健康對照組高。說明誘導化療是能通過減少MDSC的比例，能部分恢復免疫功能。

綜上所述，腫瘤患者免疫功能與腫瘤發生、發展，以及對患者預后的影響已經受到廣大學者們的廣泛關注，本研究對鼻咽癌不同期別、不同病理類型及誘導化療前后鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例做了初步研究，發現鼻咽癌患者外周血HLA-DR-CD33+CD14-CD11b+的MDSC比例明顯升高，提示可能與鼻咽癌免疫逃避有關，值得進一步研究。

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