激光共聚焦顯微鏡的組成及使用維護

摘 要 介紹了激光共聚焦顯微鏡（FV1000MPE，Olympus）的組成和技術參數，并根據日常使用情況和積累的經驗，總結了該套系統的使用及日常維護方法。

【關鍵詞】激光共聚焦顯微鏡 組成 使用及維護

激光共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世紀80年代隨著光學、視頻、計算機等技術飛速發展而誕生的新一代顯微鏡，在傳統光學顯微鏡基礎上，LSCM使用單光子激光作為光源，采用共扼聚焦原理和裝置，利用計算機對觀察對象進行數字圖像處理觀察、分析和輸出。可對樣品進行斷層掃描和成像，得到高分辨率的薄層光學切片（XY）；觀察和分析細胞的三維空間結構，得到多維度成像結果（XYZ）；或完成樣品的長時間延時序列成像（XYT）。LSCM已成為形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學等領域中強有力的研究工具。筆者根據多年以來在本單位大型儀器共享平臺上維護激光共聚焦顯微鏡（FV1000MPE，Olympus）的工作經驗，對該套系統的組成、使用和維護做出如下總結與交流：

1 激光共聚焦顯微鏡（FV1000MPE，Olympus）的組成和技術參數

1.1 激光光源

包括四個獨立的覆蓋可見光波長范圍的激光器（提供6個不同波長）：

（1）近紫外激光器：405nm，25mW，適用于DAPI、Hochest等染料以及FRAP等光刺激實驗；

（2）多譜線氬離子激光器：458nm、488nm、515nm，30mW，適用于FITC、GFP、YFP、ALEX488等染料；

（3）綠色激光器：559nm，15mW，適用于PI、Texas等諸多染料；（4）紅色激光器：635nm，20mW，適用于CY5、CY5.5等染料。

采用AOTF型激光整合器，將各激光器發出激光整合后通過光纖傳輸至掃描裝置，使不同激光器作為一個整體工作。按需要控制激光在樣品掃描中的強度，強度調節范圍是0.1%-100%，0.1%精度步進，實現任意區域內的激光強度控制和波長選擇。

1.2 掃描單元

后置式掃描單元，光譜型共聚焦熒光探測器，內置3個獨立光電倍增管熒光探測通道（PMT），其中包括兩個光譜通道和一個自動濾色片通道。提供CH1和CH2通道精確的光譜掃描功能，采用光柵分光、狹縫收集。配備3個熒光通道，及1個透射光通道用于記錄微分干涉圖像（DIC）。通過軟件控制可實現多種掃描方式，除X、Y、Z、T任意組合等常規掃描方式外，還支持點掃描、線掃描（直線和任意曲線）、矩形掃描、雙向掃描、序列掃描、Zoom 1×—50×（局部放大掃描）等擴展掃描方式。

1.3 倒置熒光顯微鏡

倒置研究級電動顯微鏡-IX81主機，包括電動載物臺、6位物鏡轉盤及100%光路轉換器。10×、20×低倍物鏡、40×油鏡（NA=0.95）、超級色差校正物鏡60×油鏡（NA=1.35），100×油鏡（NA=1.4）均具有微分干涉（DIC）拍攝功能。以上物鏡能夠兼顧生物樣本的熒光及DIC觀察拍照。

1.4 活細胞恒溫培養系統

配備高級焦點防漂移ZDC和系統適配器，活細胞培養小室可保持恒定CO2、溫度和濕度，保證培養皿內活細胞能進行長時間的延時序列成像。

2 激光共聚焦顯微鏡操作規程

標準開關機流程（所有硬件設備需要先開開關、后開鑰匙）：

（1）開啟電動顯微鏡控制器：IX2-UCB；

（2）開啟汞燈電源：U-RFL-T （開啟半小時內不能關閉）；

（3）開啟電動載物臺控制器：PRIOR；

（4）開啟主掃描單元控制器：MAIN-PSU；

（5）開啟SIM掃描單元控制器：SIM；

（6）開啟488多線氬離子激光器電源；

（7）開啟559激光器電源（兩個綠燈都亮時，開啟鑰匙，稍后等兩個紅燈都點亮時，激光出光穩定，此時可使用559激光）；

（8）開啟405/635/AOFT電源控制器：FV10-MCPSU；

（9）開啟電腦；

（10）開啟軟件FV10-ASW；

（11）獲取圖像：使用倒置熒光顯微鏡觀察生物樣本，找到觀察區域，關閉顯微鏡熒光光閘（shutter），使用激光進行掃描預覽，采用Focus×2鍵快速預覽，調整激光器（Laser）輸出功率、探測器靈敏度（HV）、光電倍增管增益（gain）、降噪（offset）等，以達到最佳成像效果。為防止熒光串色，選用順序掃描模式（seqential），降低掃描速度，并選用kalman去噪模式，獲取圖象并保存；

（12）關機（所有硬件先關鑰匙，后關開關）：先關軟件和電腦，再關閉各個硬件控制器。注意：488多線氬離子激光器電源鑰匙關閉之后，等待5-10分鐘，再關閉開關（以保證風扇繼續工作5-10分鐘，保證儀器散熱）。

3 激光共聚焦顯微鏡系統的日常管理與維護

“工欲善其事，必先利其器”，激光共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器，它的正常運轉離不開科學的日常管理及養護。

3.1 儀器負責人管理制度

為激光共聚焦顯微鏡指定儀器負責人，由專人負責儀器的開關機，規范的開關機對于儀器，尤其是激光器及汞燈的維護極為重要，并由負責人每天檢查儀器的運行狀態。

3.2 儀器預約使用

激光器和汞燈均屬于耗材性的配件，使用壽命有限。尤其是激光器，價格昂貴，在幾萬至幾十萬元不等。充分利用好儀器的開機時間，避免儀器空轉顯得格外重要。本中心要求使用人員通過儀器共享平臺的網絡預約，依次按序預約使用儀器。一旦出現超過半小時以上的空檔時間，由儀器負責人及時協調儀器使用，通知預約較晚時間點的人員提前使用，避免儀器開機空轉造成的浪費。

3.3 使用光盤或者網盤保存數據

嚴禁插拔U盤或者硬盤拷貝數據，使用儀器共享管理系統的網盤傳輸或者光盤刻錄數據結果，杜絕病毒侵染激光共聚焦顯微鏡系統。

參考文獻

[1]王珺，王燕，龔堅，唐微.激光共聚焦顯微鏡的應用技術[J].現代儀器，2009，15（04）：50-52.

[2]尹偉，肖貴鳳，劉雙雙，吳航軍，孫啟才.倒置激光共聚焦顯微鏡的共享使用與維護[J].生命科學儀器，2015，13（06）：46-49.

作者簡介

王文潔（1984-），女，江蘇省南京市人。碩士。博士在讀，助理研究員。研究方向為放射生物學，實驗室管理。

作者單位

蘇州大學唐仲英血液學研究中心 江蘇省蘇州市 215123