肝細胞癌中循環腫瘤細胞的檢測技術及臨床應用進展

彭邦劍，黃文斌，趙娟娟，潘明新

(南方醫科大學珠江醫院，廣州 510280)

肝細胞癌(HCC)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，多數患者就診時已處于中晚期，錯過了根治性手術的最佳時機，即使可行手術治療，術后也極易復發，預后較差。早發現、早診斷、早治療可明顯提高HCC患者的生存時間和生存質量。甲胎蛋白(AFP)作為HCC最經典的血清腫瘤標志物，已在臨床上普遍使用，但其敏感性和特異性都不令人滿意。因此，尋找敏感、特異的腫瘤標志物一直臨床研究的熱點。循環腫瘤細胞(CTCs)是存在于外周血循環中各類腫瘤細胞的統稱，可自發或因診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落。大部分CTCs在進入外周血后發生凋亡或被吞噬，只有極少數腫瘤細胞在循環系統中存活下來。由于其在人體外周血中含量極少，在大量的血細胞中富集并鑒定出這一類特殊細胞非常困難。目前主要通過物理特性或生物學特性等從外周血中富集CTCs，富集到的CTCs再經免疫熒光標記法、RNA原位雜交法、流式細胞術、細胞的核質比例法進一步排除非CTCs。現已證實，CTCs在肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤血行轉移過程中發揮關鍵作用[1]。本文結合文獻就HCC中CTCs的檢測技術及其臨床應用研究進展作一綜述。

1 HCC外周血中CTCs檢測技術

CTCs在腫瘤患者外周血中含量極少，即使在已知的轉移性腫瘤患者外周血中也存在很少，故從大量血細胞中富集并鑒定出這一類特殊細胞非常困難。目前，臨床上可用于富集CTCs的技術近百余種，其原理主要是基于CTCs的物理特性和生物學特性，但均無法避免血細胞污染。要進一步明確CTCs與腫瘤生物學的關系，避免其他細胞的影響，必須對富集的CTCs進行鑒定。目前常用的鑒定方法主要有基于免疫熒光標記法、RNA原位雜交法、流式細胞術、細胞的核質比例法等。

1.1 CTCs富集技術 基于CTCs物理特性的技術主要集中在尺寸大小、可塑性、密度梯度或介電性質等方面。由于CTCs密度比紅細胞、中性粒細胞小，依據這一特性，通過密度梯度離心的方法分離外周血中不同的細胞組分，這是早期分離CTCs的方法，目前已很少單獨使用該方法富集CTCs。商業化產品CanpatrolTM系統、ISET?系統和ScreenCell?系統等利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜富集CTCs，由于白細胞尺寸偏小且容易形變，能通過微孔被去除，而CTCs尺寸較大且細胞骨架較硬，不易形變，很難通過濾膜而被截留下來。Qi等[2]通過CanpatrolTM系統從112例HCC患者(包含早期HCC)外周血中富集CTCs，其中111例患者富集到CTCs。ApoStream?系統是利用電介質的差異來富集CTCs，其在血液中捕獲腫瘤細胞的效率超過75%，其捕獲的MDA-MB-231細胞的存活率高于97.1%，并且培養至第7天時細胞生長沒有差異。由于根據物理特性篩選CTCs易混雜其他血細胞，并且可能會遺漏掉部分腫瘤細胞，目前采用物理特性的方法富集CTCs的研究越來越少。

在生物學特性中，大多數方法是基于免疫親和性，如免疫磁珠富集法、流式細胞術分選等。免疫磁珠富集法是指依靠細胞表面標志物，將抗體包被在磁珠表面成為免疫磁珠，主要分為正向富集和負向富集。CellSearch?系統采用正向富集的策略，基于上皮細胞黏附分子(EpCAM)陽性CTCs，將腫瘤細胞上皮標志物EpCAM抗體包被在磁珠表面，通過EpCAM抗體特異結合在CTCs表面，在外加磁場的作用下分選出CTCs。Sun等[3]采用CellSearch?系統對73例接受HCC手術患者進行CTCs分布模式研究，結果發現，在外周靜脈血、外周動脈血、肝靜脈、肝后下腔靜脈和門靜脈中富集到CTCs的患者比例分別為68.49%、45.21%、80.82%、39.72%和58.90%。負向富集是通過剔除血細胞的方法來分選CTCs。Guo等[4]采用負向富集的方法結合多標志物組合模型對60例HCC患者外周血進行觀察，結果發現術后1個月患者外周血CTCs明顯下降。表明CTCs模型在HCC診斷中具有較高的敏感性和特異性，可作為風險預測和治療監測的實時參數。此外，隨著流式細胞術分選技術的發展，其也逐漸被用于CTCs富集。有研究發現，流式細胞分選技術檢測CTCs在體外是可行的，并與RT-PCR檢測結果一致，但其在體內檢測敏感性較差，與RT-PCR檢測結果不一致，這使流式細胞術單獨應用于CTCs富集受到了限制。但流式細胞術聯合其他富集技術在CTCs提純方面具有較好的效果，為進一步在形態學、細胞學、遺傳學等方面分析CTCs提供了基礎[5]。D′Avola等[6]描述了一種結合成像流式細胞儀和單細胞RNA測序(scRNA-seq)來識別患者CTCs的方法，其利用CD45陰性富集去除白細胞，然后使用IFC選擇CTCs，最后進行scRNA-seq，該系統捕獲效率高達65%，并且該系統獲得的CTCs基因表達譜存在明顯異質性，這或許可為個性化檢測CTCs以及制定相關治療方案提供新方法。但到目前為止，基于EpCAM的CellSearch?系統仍然是惟一一個獲得FDA(2004年獲批)和CFDA(2012年獲批)批準,用于惡性腫瘤檢測CTCs的商業化產品。

微流控芯片技術富集CTCs需要極少的血液數量，無論是基于物理特性還是生物學特性，均具有較高的敏感性，近年來受到越來越多關注。當外周血細胞流過微流控芯片時，目標抗體陽性的CTCs將會停留下來。有研究將配體-受體結合測定應用于微流體裝置中的CTCs芯片，其在人造CTCs血液樣品中的捕獲率超過85%，在36例HCC患者中檢測到的CTCs為(14±10)個/2 mL[7]。Qin等[8]開發了一種新型簡單的楔形微流體裝置，用于高效分離癌癥患者血液樣本中的CTCs，該方法對HepG2、SKBR3、A549、BGC823四種肝癌細胞表現出優異的分離性能(超過85%的捕獲效率)；在臨床試驗中，該平臺鑒定的HCC患者外周血CTCs陽性率為83.3%。類似地，HB Chip、GEM Chip和GO Chip通過設計微管道的結構，并在管道上包被EpCAM抗體，當外周血流經包被有EpCAM抗體的管道時，CTCs被捕獲并固定在芯片表面上。目前，采用多種抗體組合模型的微流控芯片技術用于富集HCC患者外周血CTCs已經成熟，這種方法有能力去捕獲那些EpCAM低表達或者不表達的CTCs，但這種方法必須找到合適的標志物區別于非CTCs，才能被臨床應用。此外，Kalinich等[9]介紹了一種高通量微流體的CTC-iChip，它能有效地從血液標本中消耗造血細胞，并為CTCs提供保存完好的RNA，可為后續下游形態學、免疫細胞學和遺傳學等研究提供完整的細胞結構。

CTCs富集技術多種多樣，無論是基于物理特性還是生物學特性，都不能很好地解釋遺漏CTCs或者白細胞污染的問題，多重富集技術的組合模型可能是未來的一條出路，但要如何將這些技術規范化、正規化是一個難點，相信不久的將來會有更多新的CTCs富集方法或者組合模型出現，為后續的CTCs與HCC轉移復發等機制的研究開辟新的道路。

1.2 鑒定技術 免疫熒光標記是最常用的一種CTCs鑒定技術，該技術主要基于細胞抗原-抗體反應來將CTCs區別于其他細胞，故合適的熒光抗體或熒光抗體組合是關鍵。CellSearch?系統是使用該方法對CTCs進行鑒定，在這個平臺上，通過使用一種核內染色劑(DAPI)來進行免疫組化染色，其中的熒光抗體可特異性反向結合CD45，也可與CK8、CK18、CK19(細胞質上皮標志物)結合。但有研究發現，CTCs在脫離腫瘤組織進入血液進行遠處轉移的過程中，會發生上皮-間質轉化(EMT)。與其他上皮性腫瘤不同，大部分HCC細胞并不表達EpCAM，這在一定程度上限制了基于EpCAM技術在臨床上的應用。Liu等[10]使用一種基于磁珠負性富集的方法去除CD45+白細胞，并改進了識別CTCs的標志物，該團隊應用三種組合抗體——CD45-、去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)來標記HCC外周血CTCs，最后采用三重免疫熒光染色處理的方法，將目標細胞分選出來，結果在91%(29/32)的HCC患者中檢測到了ASGPR和(或)CPS1+CTCs，而在其他腫瘤患者中未檢測到，抗ASGPR和CPS1單克隆抗體的混合物比單獨任一抗體鑒定HCC細胞的敏感性和特異性明顯增加。此外，包括DAPI+、CD45-、ASGPR+、HspPar1+、DAPI+、CD45-、CK+、pERK/Akt+等在內的標志物抗體組合也被用于CTCs的鑒定技術。

通過多重探針標記的RNA原位雜交法實現CTCs鑒定和分型也是常見的鑒定方法之一。Canpatrol系統[11]即是應用這一原理，該系統針對EMT途徑，同時對上皮標志物(如EpCAM、CK8、CK18、CK19)和間質標志物(如Twist、Vimentin)進行檢測。有研究表明，在HCC患者外周血中，間質型CTCs更多見于出現轉移患者的外周血樣本中，并且存在的數量越多，提示患者預后越差[12]。Qi等[2]應用該系統發現，112例HCC患者(包含早期HCC)中有111例(90.18%)CTCs陽性；另外，在12例乙型肝炎病毒感染患者中，有2例患者亦檢測到CTCs，這2例患者在5個月內均檢測到微小HCC。除了商業化產品Canpatrol系統外，Guo等[4]對HCC外周血首先采用CD45負性富集，然后利用qRT-PCR的方法對多標記物表征(EpCAM、CD133、CD90和CK19)的CTCs進行鑒定，結果發現該鑒定技術在HCC的診斷中具有高度敏感性和特異性，可作為風險預測和治療監測的實時參數。

免疫熒光標記法和RNA原位雜交法是目前常用的兩種CTCs鑒定技術，但是這兩種技術都高度依賴相應的標志物，表征CTCs標志物不同將直接導致CTCs鑒定的敏感性和特異性不同。此外，基于流式細胞術、細胞的核質比例法等也有文獻報道。Ogle等[13]首先采用負向富集的方法剔除血細胞，剩下的細胞懸液采用流式細胞成像術檢測細胞角蛋白、EpCAM、AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和DNA-PK，然后分析大小、形態和DNA含量，依此來鑒定HCC外周血CTCs，結果發現，在65.2%的HCC患者血液樣本中檢測到1～1 642個CTCs。Guo等[14]發現了一種新的策略來檢測HCC外周血CTCs，同樣利用流式細胞儀分選，該系統基于HCC患者外周血細胞的核質比例聯合生物標志物EpCAM和CD45分選CTCs，而不是傳統的單一標志物或者多標志物聯合檢測，結果發現這個新的CTCs鑒定方法更敏感和更可靠。

CTCs能否預測臨床結局并進一步評估抗腫瘤藥物的治療效果，最終還要依賴CTCs鑒定技術是否準確可靠。但至今關于HCC的CTCs檢測仍然沒有統一標準，其檢測結果的準確性和可靠性是CTCs在臨床應用中面臨的最大挑戰，不斷提高CTCs檢測技術并使之規范化成為了今后研究CTCs的重點。

2 HCC外周血CTCs檢測的臨床應用

目前多種多樣的富集方法和多分子靶標聯合應用已經使得肝癌CTCs的富集與鑒定技術獲得了較好的敏感性和特異性，在臨床分期、預后評價和療效評估等方面已經逐步開展相應的研究并取得了一定成果。

2.1 臨床分期 研究表明，外周血CTCs陽性率及腫瘤分期(BCLC分期、TNM分期)呈正相關關系，有肉眼血管侵犯及肝外轉移患者體內CTCs陽性率更高。Schulze等[15]應用CellSearch?系統檢測HCC外周血發現，CTCs計數與患者總生存率、BCLC分期、微血管侵犯、AFP等密切相關，這與Sun等[1]報道基本一致。CTCs分為上皮型、混合型、間質型三種，不同表型的CTCs能從不同方面反映HCC患者臨床特征，可作為評估HCC患者病情的輔助指標。應用CellSearch?系統檢測HCC外周血CTCs時還發現，在很多TNM分期提示為早期HCC患者外周血中也能檢測到CTCs[8]，這從側面反映HCC早期即有可能發展為全身性疾病，僅僅依靠現有的臨床分期不能真實反映HCC的生物學特點。因此，倘若能夠將CTCs應用于常規檢查，如同乳腺癌一樣納入NCCN指南將會有利于HCCs患者的早期診斷，并能監測患者預后，進而延長患者的生存期。

2.2 預后判斷 Sun等[1]首次描述了在HCC患者中使用CellSearch?系統檢測EpCAM陽性CTCs，認為術前CTCs計數≥2是HCC患者術后復發的預測因子。有文獻報道，CTCs計數與HCC患者不良臨床病理特征相關，并且可能預示患者預后不良，Sun等[16]的薈萃分析也證實了這一結論。Wang等[12]采集了62例行根治性切除術后HCC患者外周血5 mL，采用CanPatrol系統進行分析，發現切除術后總CTCs、混合型CTCs和間質型CTCs復發率明顯增高，而上皮型CTCs復發率沒有差別。Ou等[17]應用CanPatrol系統在根治性手術前從165例HCC患者獲得外周血樣品檢測CTCs，結果表明間質型CTCs的存在提示最短的無復發生存率，其次是混合型CTCs，然后是上皮型CTCs，這與Wang等[18]報道基本一致。

2.3 療效評估 CTCs的檢測在評價分期及預后方面已有大量文獻報道，然而在監測療效方面相對較少。Shen等[19]評估了EpCAM陽性CTCs計數在預測不能切除的HCC患者經導管動脈化療栓塞后死亡風險，將89例患者分為3組，即低度組(CTCs計數為0～1)、中度組(CTCs計數為2～5)和高度組(CTCs計數≥6)，結果發現高、中度組死亡風險分別為低度組的2.819(95%CI：1.218～6.526)、1.301倍(95%CI：0.630～2.685)。Guo等[4]對多標記物表征的肝細胞特征CTCs進行大樣本研究，結果證實其在HCC中具有高度敏感性和特異性，可作為風險預測和治療監測的實時參數，腫瘤切除后CTCs負荷持續高值患者具有明顯復發傾向，可早期制定有效的抗腫瘤策略。此外，包括pERK和pAkt，EMT標志物(Twist和波形蛋白)，MAGE-3和生存素，CK、EpCAM和Glypican-3，膜聯蛋白V、EpCAM、ASGPR1和TAMPs等多標記組合的CTCs檢測也可用于評估轉移、預后以及監測藥物治療效果。

綜上所述，CTCs分析可能為臨床醫生和研究人員提供個性化策略，因為CTCs是敏感的生物標志物，有望在早期診斷、預后評價、實時監測和藥物耐藥等方面發揮重要作用，以促進精準醫學的實施。因此，進一步篩選高存活力、高轉移性的肝癌CTCs子集，是深入研究HCC靶向轉移機制的關鍵一步。然而，在臨床上應用CTCs分析前，必須建立一種能夠捕獲全部CTCs高敏感性和特異性的方法。目前，大多數研究是單中心病例對照研究，樣本量有限，今后需要進行足夠樣本量和長期隨訪的多中心前瞻性研究，以評估CTCs檢測和鑒定方法，以便CTCs更好地用于HCC臨床分期、預后評價和療效評估等。