原花青素對尿路致病性大腸桿菌黏附、侵襲膀胱上皮細胞的影響及其機制

沙凱輝，劉同剛，張曉麗

(1 濱州醫學院，山東濱州 256600；2 濱州醫學院附屬醫院)

尿路感染是一種常見反復發作的感染性疾病。尿路致病性大腸桿菌(UPEC)是健康成年人尿路感染的主要侵入性病原體[1～3]。細胞骨架微絲的主要成分為球狀肌動蛋白，在多種因素作用下可聚合成纖維狀肌動蛋白(F-Actin)[4～6]。這一肌動蛋白的動力學改變可引起細胞骨架重排，驅動細胞質膜擴展、形變等，以便于UPEC等病原菌侵襲膀胱上皮細胞。整合素是由α和β亞基組成的異源二聚體，是一種重要的跨膜受體，可調節胞外基質蛋白和肌動蛋白細胞骨架之間的相互作用。原花青素是一種復雜的黃酮類天然聚合物。已有研究證實，原花青素具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤的生物學活性[7～12]。2017年7月～2018年3月，本研究探討原花青素對UPEC黏附、侵襲膀胱上皮細胞的影響及其機制，旨在為防治尿路感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱上皮細胞株T24(ATCC HTB-4)購自中國科學院上海細胞庫，-150 ℃冰箱保存。UPEC J96(血清型O4：K6，ATCC 700336)購自ATCC，- 70 ℃冰箱保存。自冰箱內取出細菌，室溫下緩慢溶解；取50 μL菌液接種于5 mL LB肉湯液體培養基中，37 ℃、170 r/min振蕩培養過夜；用接菌環將細菌接種于TSA固體培養基中，37 ℃培養過夜形成單菌落，4 ℃冰箱保存備用，保存期約1周。

1.2 細胞培養與分組處理 自冰箱內取出T24細胞，37 ℃溫水中快速溶解，轉移至含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素RPMI 1640培養基的離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清，更換新的培養基，輕輕吹打混勻。將細胞接種于培養皿中，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。將T24細胞接種于24孔板中，每孔2.5×105個，置于細胞培養箱中過夜，隨機分為空白對照組、陰性對照組和原花青素組，每組設3個復孔。陰性對照組和原花青素組分別加入等量DMSO和亞抑菌濃度的原花青素孵育40 min。

1.3 UPEC對T24細胞黏附能力的影響 采用平板菌落計數法。用細菌接種環從LB固體培養基上挑取單菌落并接種于5 mL LB液體培養基中，37 ℃、170 r/min搖床振蕩過夜；取50 μL菌液加入5 mL LB液體培養基中繼續搖床培養3 h，達到對數生長期；3 000 r/min離心3 min，棄去上清，收集細菌，加入一定量PBS重懸；紫外分光光度計檢測625 nm波長處的光密度值為0.6時，細菌濃度為1×109CFU/mL；用無血清無雙抗的RPMI 1640培養基按照100∶1的感染復數重懸細菌，振蕩混勻，備用；將各組細胞用3倍體積的預溫無菌PBS清洗，隨后將重懸后的菌液接種于24孔板內，置于37 ℃孵箱中孵育，使細菌感染細胞；孵育2 h，以3倍體積的預溫PBS清洗孔板，洗去未黏附細菌；每孔加入的0.25% TritonX-100溶液200 μL充分裂解細胞，反復吹打，收集至無菌EP管，每孔加入無菌PBS 800 μL清洗，同樣收集至EP管，漩渦振蕩混勻；以10倍稀釋法梯度稀釋10 000倍后，吸取100 μL細胞裂解液涂布于LB瓊脂平板上。37 ℃恒溫孵箱倒置培養，次日菌落計數。以空白對照組的黏附率為100%，計算陰性對照組和原花青素組相對黏附率。

1.4 UPEC對T24細胞侵襲能力的影響 感染2 h，每孔加入500 μL含100 μg/mL慶大霉素的RPMI 1640培養基，37 ℃孵育2 h以殺死胞外菌；以3倍體積的預溫PBS清洗孔板，充分洗去慶大霉素；每孔加入的0.25% TritonX-100溶液200 μL充分裂解細胞，反復吹打，收集至無菌EP管，每孔加入無菌PBS 800 μL清洗，同樣收集至EP管，漩渦振蕩混勻；以10倍稀釋法梯度稀釋100倍后，吸取100 μL細胞裂解液涂布于LB瓊脂平板上。37 ℃恒溫孵箱倒置培養，次日菌落計數。以空白對照組的侵襲率為100%，計算陰性對照組和原花青素組相對侵襲率。

1.5 T24細胞表面整合素受體α3、β1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。提取總RNA：按照總RNA提取試劑盒說明提取各組細胞總RNA，置于-70 ℃保存備用。RNA逆轉錄合成cDNA：參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。實時熒光定量PCR：使用real-time PCR儀，參照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×)說明書將各反應試劑混勻后加入PCR管，短暫離心后置于PCR儀，設置好反應程序進行反應。Integrin α3正向引物：5′-AAGGGACCTTCAGGTGCA-3′，反向引物：5′-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3′；Integrin β1正向引物：5′-GAAGGGTTGCCCTCCAGA-3′，反向引物：5′-GCTTGAGCTTCTCTGCTGTT-3′；內參GAPDH正向引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.6 T24細胞F-Actin表達檢測 采用流式細胞術。以預冷的PBS(1 mL/孔)清洗細胞3次；0.25%胰酶消化2 min；預冷的含10%血清培養基終止消化，收集至EP管，1 000～3 000 r/min離心3 min，棄上清；預冷的PBS清洗1次，離心棄上清；加入4%多聚甲醛500 μL混勻，室溫靜置15 min；PBS稀釋離心棄上清，預冷的PBS清洗1次；加入0.1%曲拉通500 μL混勻，室溫靜置10～20 min；PBS稀釋離心棄上清，預冷的PBS清洗1次；加入5 μg/mL羅丹明-鬼筆環肽160～180 μL振蕩混勻，室溫避光1 h；PBS稀釋離心棄上清，預冷PBS清洗2次；400 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測各組細胞F-Actin的相對熒光強度。

2 結果

2.1 各組黏附率、侵襲率比較 空白對照組、陰性對照組、原花青素組相對黏附率分別為(100.00±0.00)%、(109.05±2.21)%、(82.91±3.35)%，相對侵襲率分別為(100.00±0.00)%、(111.43±8.70)%、(77.14±6.56)%。與陰性對照組和空白對照組比較，原花青素組相對黏附率、相對侵襲率均明顯降低(P均<0.01)，而陰性對照組與空白對照組比較P均>0.05。

2.2 各組T24細胞表面整合素受體α3、β1 mRNA表達比較 空白對照組、陰性對照組、原花青素組T24細胞表面整合素受體α3 mRNA相對表達量分別為1.01±0.09、0.91±0.10、0.42±1.07，T24細胞表面整合素受體β1 mRNA相對表達量分別為3.41±0.12、3.55±0.23、1.07±0.26。與陰性對照組和空白對照組比較，原花青素組T24細胞表面整合素受體α3、β1 mRNA相對表達量均明顯降低(P<0.01)，而陰性對照組與空白對照組比較P均>0.05。

2.3 各組F-Actin相對熒光強度比較 空白對照組、陰性對照組、原花青素組未經UPEC J96感染細胞的F-Actin相對熒光強度分別為24.95±1.06、25.40±0.72、22.43±0.87，經UPEC J96感染細胞的F-Actin相對熒光強度分別為30.13±2.97、32.40±3.56、24.33±1.00。與陰性對照組和空白對照組比較，原花青素組無論是UPEC J96未感染細胞還是UPEC J96感染細胞，F-Actin相對熒光強度均明顯降低(P均<0.01)，而空白對照組與陰性對照組比較P均>0.05。

3 討論

尿路感染是一種常見的感染性疾病，每年全世界有1.5億人發生尿路感染，1 400萬人因尿路感染而入院，估計每年用于衛生保健的總成本約60億美元[2,13～15]。UPEC主要導致急性膀胱感染(膀胱炎)和腎感染(腎盂腎炎)，并可引起嚴重慢性腎功能衰竭或菌/敗血癥。尿道黏膜是病原微生物定植最為棘手的部位之一，黏附和侵襲是UPEC等尿路致病菌逃避宿主免疫反應和抗生素治療最重要的策略，可促進病原體更有效地定植于尿道并引發感染[16]。本研究發現，原花青素預處理膀胱上皮T24細胞后，UPEC J96對膀胱上皮細胞的黏附和侵襲能力均明顯降低。

在最為常見的膀胱感染中，最關鍵的一步即是UPEC等尿路致病菌利用其表達的Ⅰ型菌毛黏附素FimH與膀胱上皮細胞膜表面含有甘露糖殘基的蛋白受體uroplakin Ⅰa及整合素α3/β1等結合[1,17]，進而激活多條細胞內信號級聯，介導UPEC等病原菌侵襲進入膀胱上皮細胞。整合素是由α和β亞基組成的異源二聚體，是一種重要的跨膜受體，可調節胞外基質蛋白和肌動蛋白細胞骨架之間的相互作用[18～20]。UPEC UTI89可直接或間接通過基質蛋白與α3/β1整合素受體結合，進而侵襲宿主細胞[19]。本研究結果顯示，原花青素可明顯降低T24細胞整合素α3/β1表達，提示原花青素可能通過調節α3/β1整合素受體表達，繼而減少UPEC黏附，從而通過下游信號通路抑制肌動蛋白聚合和UPEC侵襲。

真核細胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維構成，其中微絲主要發揮支撐、非肌性運動和信息傳導作用，微管則主要用于維持細胞形態及輔助細胞內運輸[21]。眾所周知，UPEC可改變宿主的信號級聯活化并使宿主微絲肌動蛋白聚合重排，這是UPEC侵襲宿主細胞所必需的[22]。本研究發現，原花青素預處理T24細胞，可明顯抑制骨架微絲肌動蛋白聚合，進而減少UPEC侵襲。因此，原花青素所致的UPEC侵襲減少可能依賴于Actin多聚態F-Actin表達降低。

綜上所述，原花青素可通過抑制膀胱上皮細胞表面整合素受體表達，從而減少UPEC對膀胱上皮細胞黏附；通過抑制F-Actin表達，抑制UPEC侵襲膀胱上皮細胞。