中華蜜蜂促分裂原活化蛋白激酶ERK-A基因的克隆與低溫表達(dá)分析

陳文鳳 張衛(wèi)星 王紅芳 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)部分是由一系列胞內(nèi)信號(hào)途徑來(lái)誘導(dǎo)的，信號(hào)通路接替、放大并整合來(lái)自胞外刺激的信號(hào)，最終導(dǎo)致基因和生理的改變。昆蟲(chóng)為適應(yīng)極端環(huán)境，體內(nèi)會(huì)啟動(dòng)一系列代謝和調(diào)控反應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理過(guò)程，不僅應(yīng)答生物脅迫中的病原體感染，也對(duì)鹽、高溫、低溫、干旱等非生物脅迫有響應(yīng)[1,2]。MAPK信號(hào)通路主要由ERK（extracellular signalregulated kinases）、JNK（The c-Jun amino-terminal kinases）和p38等并行的幾條信號(hào)通路組成。JNK主要參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，p38主要參與細(xì)胞對(duì)炎癥因子和環(huán)境脅迫（UV、溫度、缺血缺氧）的響應(yīng)，而ERK信號(hào)通路主要參與調(diào)控細(xì)胞分裂過(guò)程。ERK信號(hào)通路在MAPK信號(hào)通路中最早被發(fā)現(xiàn)且研究得最為深入。ERK包括ERK-1和ERK-2兩種激酶，該途徑主要介導(dǎo)有絲分裂信號(hào)向胞內(nèi)和核內(nèi)傳遞，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程[3]。

應(yīng)激反應(yīng)是受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，MAPK、G蛋白耦聯(lián)受體以及TGF-β等信號(hào)通路都參與應(yīng)激反應(yīng)[4,5]。當(dāng)動(dòng)物處于冷應(yīng)激條件下時(shí)，動(dòng)物機(jī)體作為一個(gè)整體發(fā)生反應(yīng)，其神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等均發(fā)生一系列多系統(tǒng)、多層次的協(xié)調(diào)效應(yīng)，以提高機(jī)體的適應(yīng)能力和維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。動(dòng)物應(yīng)激及動(dòng)物對(duì)應(yīng)激原的適應(yīng)具有分子基礎(chǔ)，可以認(rèn)為是一種基因行為[6,7]。任何機(jī)體酶和蛋白質(zhì)的差異，其根本原因是基因表達(dá)的差異。在冷應(yīng)激過(guò)程中主要表現(xiàn)為蛋白合成率的總體下降，但是某些蛋白的合成反而上升或嚴(yán)重下降，說(shuō)明他們的表達(dá)受到了冷應(yīng)激的特異性調(diào)節(jié)，并可能在冷應(yīng)激過(guò)程中扮演重要角色[8]。ERK-A信號(hào)通路可將胞外刺激與胞內(nèi)功能聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)研究ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制可以了解冷應(yīng)激對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，ERK通路通過(guò)調(diào)節(jié)類固醇和山梨醇的合成來(lái)終止家蠶幼蟲(chóng)的滯育過(guò)程，表明ERK通路參與了昆蟲(chóng)在低溫條件下的代謝調(diào)節(jié)[9,10]。

雖然對(duì)蜜蜂抵抗低溫的生理生化機(jī)制已有很多研究[11]，但信號(hào)通路在中華蜜蜂低溫響應(yīng)機(jī)制中的作用還鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)將中華蜜蜂成蟲(chóng)置于4℃環(huán)境下4 h，并在處理過(guò)程中取樣，取樣在3 min內(nèi)完成，取樣后立即將蜜蜂放回原處理?xiàng)l件下。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ERK-A基因的表達(dá)量，探討ERK-A基因是否在中華蜜蜂適應(yīng)低溫環(huán)境中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 供試蜂種

中華蜜蜂（簡(jiǎn)稱中蜂，A.cerana cerana），飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究基地。

1.2 主要試劑

BL21（DE）和感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，克隆載體pEasy-T3購(gòu)于TransGen公司，原核表達(dá)載體Pet-30a(+)由本實(shí)驗(yàn)室提供。TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP、DNA Marker、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit、各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司（TaKaRa）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于Solarbio公司；質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit購(gòu)于OMEGA公司；引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 PCR引物（表1）

表1 PCR引物

1.4 中華蜜蜂ERK-A基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6.0軟件將ERK-A基因的開(kāi)放讀碼框翻譯成氨基酸序列，得到蛋白，在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上將ERK-A同其它物種進(jìn)行Blast同源比對(duì)。在亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://psort.hgc.jp/form.html)上預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置，利用MEGA 5軟件對(duì)不同物種ERK-A基因序列進(jìn)行多重比對(duì)，通過(guò)NJ(neighbor joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 中華蜜蜂的低溫處理

選取正常蜂群中的中華蜜蜂320只，分成4組，每組80只，隨機(jī)選取三組在4℃冰箱中放置15 min、30 min、1 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h，另一組放置于25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，處理后直接將蜜蜂凍存在液氮中，將25℃飼養(yǎng)的蜜蜂成蟲(chóng)作為對(duì)照，不作低溫處理直接凍存在液氮中，以單只蜜蜂為一個(gè)樣品，每個(gè)處理共3只蜜蜂（即3次重復(fù))。

1.6 中華蜜蜂總RNA的提取、cDNA的合成以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

每群選取2只蜜蜂液氮研磨，Trizol法提取總mRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa：DRR037A）立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度于相同水平后，-20℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR取1000 ng cDNA加入到20 μl熒光定量體系中，按照熒光定量試劑盒（TaKaRa）操作指南，用7500 Real-Time PCR儀（ABI 7500，USA）檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，10 s；變性95℃，5 s；退火60℃40 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線添加，1個(gè)循環(huán)。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來(lái)自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，以action為內(nèi)參，采用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托生工生物科技有限公司合成引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華蜜蜂ERK-A基因cDNA的克隆（圖1）

圖1 ERK-A基因克隆

2.2 中華蜜蜂ERK-A基因cDNA的序列分析

通過(guò)DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行分析獲得中華蜜蜂ERK-A基因的開(kāi)放讀碼框，含有1098 bp的堿基，編碼365個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)命名為ERK-A，其分子量為42 kDa，等電點(diǎn)為6.03。ERK-A1/2 是細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答的上游樞紐，通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(http://psort.hgc.jp/form.html)，ERK-A主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，且無(wú)信號(hào)肽編碼序列，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(圖2)。ERK-A具有MAPK超家族的序列特征，即存在激酶的保守區(qū)和磷酸化位點(diǎn)(下劃線標(biāo)的TEY序列)。

圖2 中華蜜蜂ERK-A的核酸與氨基酸序列

2.3 中華蜜蜂ERK-A蛋白的同源性分析

圖3 中華蜜蜂與其他物種的同源比對(duì)

將ERK-A的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明ERK-A與同為蜜蜂科Apis mellifera（GenBank登錄號(hào)：XP_393029.2）的相似性最高，一致性99.18%，與Harpegnathos saltator （GenBank登錄號(hào)：XP_017789097.1）的一致性97.81%。與Eufriesea Mexicana和Melipona quadrifasciata的一致性都在97%以上（圖3），說(shuō)明該基因在進(jìn)化上高度保守。

2.4 中華蜜蜂ERK-A基因的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及磷酸化位點(diǎn)分析

MAPK的激活都是通過(guò)TEY基序中蘇氨酸(T)和酪氨酸（Y）的同時(shí)磷酸化實(shí)現(xiàn)的。利用SWISSMODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)ERK-A激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4），可以看出，N端結(jié)構(gòu)域主要由β折疊組成，C端結(jié)構(gòu)域主要由α螺旋組成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的裂痕(即無(wú)規(guī)則卷曲)為ATP結(jié)合的激活環(huán)，TEY基序就位于激活環(huán)內(nèi)[12]。

圖4 ERK-A的三維結(jié)構(gòu)剖面圖

2.5 中華蜜蜂ERK-A激酶與其他物種ERK-A激酶的系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

從NCBI網(wǎng)站下載相近物種的部分ERK-A激酶序列，利用MEGA軟件，以酵母Saccharomyces merevisiae的ERK-A作為外群，通過(guò)Test Neighbor Joining Tree方法構(gòu)建以氨基酸序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖5），結(jié)果表明：中華蜜蜂ERK-A和同為蜜蜂科的意大利蜜蜂Apis mellifera的ERK-A聚為一支，與蟻科的收獲蟻Pogonomyrmex barbatus和擬步甲科的赤擬谷盜Tribolium castaneum親緣關(guān)系較近。小鼠ERK-A和人ERK-A聚為一支，昆蟲(chóng)ERK-A與哺乳動(dòng)物ERK-A有更近的起源。

圖5 昆蟲(chóng)ERK-A的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.6 低溫脅迫下中華蜜蜂ERK-A基因的表達(dá)規(guī)律

為了研究ERK-A基因的表達(dá)是否對(duì)低溫脅迫做出響應(yīng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在低溫脅迫下ERK-A的表達(dá)均有顯著上調(diào)。在4℃脅迫30 min后，ERK-A的表達(dá)量就達(dá)到對(duì)照的2倍，2 h時(shí)達(dá)到最高峰是對(duì)照的4倍，此后雖有下降，但仍保持較高水平（圖6）。低溫表達(dá)分析說(shuō)明，ERK-A基因的表達(dá)受到低溫的誘導(dǎo)，可能在中華蜜蜂應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用。

圖6 低溫條件下ERK-A基因表達(dá)的變化

我們從蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得ERK-A基因的cDNA序列的完整開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1098 bp，編碼365個(gè)氨基酸，編碼蛋白ERK-A的分子量為42 kDa，等電點(diǎn)為6.03。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因在進(jìn)化上十分保守，在氨基酸水平上，與相近物種的ERK-A的一致性都達(dá)到97%以上，與意大利蜜蜂ERK-A的一致性達(dá)99.18%，表明ERK-A在生物體中都具有重要功能。本研究發(fā)現(xiàn)ERK-A在4℃呈上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明ERK-A通路可能參與了中華蜜蜂耐寒機(jī)制的調(diào)控。

3 結(jié)論與討論

真核細(xì)胞已經(jīng)形成了特殊的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)響應(yīng)細(xì)胞外的各種刺激，絲裂原蛋白激酶MAPK組成了一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，通過(guò)磷酸化作用激活受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和脅迫響應(yīng)[13]。在比較生物化學(xué)領(lǐng)域，MAPK信號(hào)通路在代謝調(diào)節(jié)和生化適應(yīng)方面的研究還比較少見(jiàn)，最初關(guān)于MAPK信號(hào)通路在缺氧狀態(tài)、熱應(yīng)激和冷應(yīng)激等方面的代謝應(yīng)答的研究也僅僅觸及其表面[14]。

通常認(rèn)為，ERK通路主要參與細(xì)胞存活和生長(zhǎng)繁殖，其有效激活信號(hào)分子包括生長(zhǎng)因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、鈣離子等[15]，而p38和JNK主要參與生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡，其有效激活因素有溫度、缺血缺氧等各種環(huán)境刺激[16]。ERK主要被生長(zhǎng)因子、多肽類激素以及神經(jīng)遞質(zhì)激活，控制細(xì)胞增殖、分化、生存和凋亡。本研究中，ERK-A基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，可能與ERK、p38和JNK三條通路的相互作用有關(guān)[17,18]。

本研究從中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得ERK-A基因的cDNA，該基因在低溫條件下上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明在中華蜜蜂中ERK通路可能參與了低溫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。昆蟲(chóng)的一生會(huì)經(jīng)常性受到來(lái)自環(huán)境的各種各樣的刺激，昆蟲(chóng)的誘導(dǎo)表達(dá)適應(yīng)機(jī)制提示人們，昆蟲(chóng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)是一個(gè)能動(dòng)的過(guò)程。昆蟲(chóng)通過(guò)啟動(dòng)與抗低溫有關(guān)的基因并使之表達(dá)，給出逆境保護(hù)措施，從而協(xié)助昆蟲(chóng)度過(guò)難關(guān)或逆境。因此，研究與冷應(yīng)激密切相關(guān)的基因，探討如何迅速誘導(dǎo)昆蟲(chóng)冷適應(yīng)機(jī)制的高效運(yùn)作，提高昆蟲(chóng)在不利環(huán)境下的存活率，將是現(xiàn)在乃至將來(lái)昆蟲(chóng)學(xué)家應(yīng)傾力研究的課題。此外，不同類型的應(yīng)激可以誘導(dǎo)不同的應(yīng)激蛋白，后者即可用來(lái)判斷昆蟲(chóng)受到何種應(yīng)激和應(yīng)激的程度。研究冷應(yīng)激過(guò)程中發(fā)生改變的這些蛋白用以衡量應(yīng)激的程度，作為指導(dǎo)我們工作和生產(chǎn)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，從分子水平上研究冷應(yīng)激的分子機(jī)制，將具有極大的基礎(chǔ)研究和實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值，研究MAPK信號(hào)通路對(duì)低溫脅迫的調(diào)控，有助于全面了解昆蟲(chóng)的耐寒機(jī)制。

[1] Atay O, Skotheim J M.Spatial and temporal signal processing and decision making by MAPK pathways [J].Journal of Cell Biology,2017, 216(2):317.

[2] Dent P, Yacoub A, Fisher PB, et al.MAPK pathways in radiation responses [J].Oncogene, 2003, 22(37):5885-5896.

[3] Lim W, Park S, Bazer F W, et al.Apigenin reduces survival of choriocarcinoma cells by inducing apoptosis via the PI3K/AKT and ERK1/2 MAPK pathways [J].Journal of Cellular Physiology, 2016,231(12):2690.

[4] Sonna L A, Fujita J, Gaffin SL, et al.Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression [J].Journal of Applied Physiology, 2002, 92(4):1725.

[5] 楊發(fā)青，錢(qián)令嘉，王萬(wàn)銀，等.寒冷適應(yīng)差異表達(dá)基因的研究[J].生理學(xué)報(bào)，2003, 55(3):360-363.

[6] Shinozaki K, Yamaguchishinozaki K, Seki M.Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses [J].Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6(5):410-417.

[7] 柳巨雄，欒新紅，楊煥民，等.冷休克蛋白表達(dá)的分子機(jī)制[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003, 23(6):607-610.

[8] 姜冬梅，李士澤，姜書(shū)磊，等.冷應(yīng)激動(dòng)物相關(guān)基因表達(dá)的研究進(jìn)展[J].環(huán)境與健康雜志，2006, 23(5):471-473.

[9] Fujiwara Y, Tanaka Y, Lwata K, et al.ERK/MAPK regulates ecdysteroid and sorbitol metabolism for embryonic diapause termination in the silkworm, Bombyx mori [J].Journal of Insect Physiology, 2006, 52(6):569-575.

[10] Huang, Hao-Jen, Fu, et al.Expression of Oryza sativa MAP kinase gene is developmentally regulated and stress-responsive [J].Physiologia Plantarum, 2002, 114(4):572.

[11] 陳琳，徐新建，王青，等.低溫20℃對(duì)意大利蜜蜂未受精卵發(fā)育的影響[J].應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2016, 53(3):574-580.

[12] Widmann C, Gibson S, Jarpe MB, et al.Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human [J].Physiological Reviews, 1999, 79(1):143-180.

[13] Xu J, Zhang S.Mitogen-activated protein kinase cascades in signaling plant growth and development [J].Trends in Plant Science,2015, 20(1):56-64.

[14] Cowan K J, Storey K B.Mitogen-activated protein kinases: new signaling pathways functioning in cellular responses to environmental stress [J].Journal of Experimental Biology, 2003, 206(Pt 7):1107.

[15] Johnson G L, Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases [J].Science, 2002, 298(5600): 1911-1912.

[16] Ono K, Han J.The p38 signal transduction pathway: activation and function [J].Cellular Signalling, 2000, 12(1):1-13.

[17] Wang J Y, Chen S P, Gao Y H, et al.Effect of repeated electroacupuncture intervention on hippocampal ERK and p38 MAPK signaling in neuropathic pain rats [J].Evidence-Based Complementray and Alternative Medicine, 2015, 2015(12):641286.

[18] Sinha A K, Jaggi M, Raghuram B, et al.Mitogen-activated protein kinase signaling in plants under abiotic stress [J].Plant Signaling & Behavior, 2011, 6(2):196-203.