新疆哈薩克族食管鱗癌組織中長鏈非編碼RNA MIR663AHG的表達及其相關mRNA

程麗云，史貴軍，方春曉，李光華，鄭勇，陳衛剛

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子 832000)

食管癌是起源于食管上皮的惡性腫瘤，是常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內具有較高的發病率和病死率[1]。我國是世界上食管癌發病率較高的國家之一，病理類型以鱗癌為主，其中位于新疆北部的哈薩克族是我國食管鱗癌發病率最高的民族。1990年的全國死因回顧調查資料顯示，新疆哈薩克族食管癌的標化病死率為68.95/10萬，2000～2005年較前有所下降，但仍維持在較高水平，嚴重威脅著哈薩克族人的身體健康[2]。由于食管癌早期無明顯癥狀，大部分患者確診時已達中晚期，故5年生存率較低，而早期發現并治療的食管癌患者預后明顯優于中晚期[3]，因此，建立早期的監測體系對于食管癌的診斷和治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指長度在200～1 000 nt，具有調控基因表達作用的非編碼RNA。近年來研究[4]表明，大量的lncRNA在腫瘤組織與正常組織中差異表達，而且特異的lncRNA可作為腫瘤的預測因子。有研究[5]表明，與正常組織相比，lncRNA MIR663AHG在胃癌組織中表達顯著上調，可能與胃癌的發生有一定的關聯，但lncRNA MIR663AHG在其他腫瘤中的作用研究較少。本研究通過qRT-PCR方法觀察lncRNA MIR663AHG在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中的表達情況，并進一步分析lncRNA MIR663AHG相關的mRNA，初步探討lncRNA MIR663AHG在新疆哈薩克族食管鱗癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年11月～2015年9月來源于石河子大學醫學院第一附屬醫院兵團內鏡中心就診的17例食管鱗癌患者，其中哈薩克族7例(觀察組)、漢族10例(對照組)。觀察組男4例、女3例，年齡(66.14±5.46)歲。對照組男6例、女4例，年齡(64.43±9.25)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。所有患者經病理診斷為中分化食管鱗癌，并且在樣本采集前未行任何手術治療、放療及化療。取兩組患者食管鱗癌組織和配對的癌旁組織，迅速放入凍存管中，并立即置入液氮中儲存過夜，隨后放入-80 ℃冰箱中保存備用。本研究所有樣本的采集處理經石河子大學醫學倫理委員會批準，并征得患者和(或)家屬知情同意。

1.2 lncRNA MIR663AHG表達檢測 采用qRT-PCR法。在無RNase的條件下，應用microRNA提取試劑盒提取標本中的總RNA。利用紫外分光光度計測定樣本的吸光度值，以檢測樣本總RNA濃度和純度。組織樣本A260/A280介于1.8～2.0為合格，將合格樣品保存至-80 ℃冰箱中備用。應用Fast Quant RT試劑盒對總RNA進行逆轉錄，合成20 μL cDNA樣本，待反應結束后置于冰上。lncRNA MIR663AHG上游引物為5′-GGTACACTGGTCGACAAAACC-3′，下游引物為5′-TGGAGACGCTATCTCGGGTA-3′；GAPDH上游引物為5′-TGTTG-CCATCAATGACCCCTT-3′，下游引物為5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。qRT-PCR反應總體積為10 μL，含2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，cDNA模板0.5 μL，上下游引物各0.25 μL，無核酸酶水4 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s；60 ℃退火、延伸1 min，共40個循環。用2-ΔΔCt法計算lncRNA MIR663AHG相對表達量。實驗重復3次。

1.3 lncRNA MIR663AHG相關mRNA分析 本課題組前期通過北京博奧生物有限公司定制的Agilent人類lncRNA芯片V4.0(該芯片包含34 235個mRNA檢測探針和40 916個lncRNA檢測探針)篩選出了新疆哈薩克族食管鱗癌腫瘤組織與正常組織差異表達的lncRNA和mRNA表達譜。利用基因芯片數據，將觀察組食管鱗癌及其癌旁組織中lncRNA MIR663AHG的表達信號值與篩選出的2 475個差異表達mRNA的表達信號值的趨勢進行相關性分析，并篩選出與lncRNA MIR663AHG顯著相關的mRNA，篩選標準：相關系數>0.8或相關系數<-0.8，并且P<0.05。

2 結果

2.1 兩組lncRNA MIR663AHG表達比較 觀察組食管鱗癌組織、癌旁組織中lncRNA MIR663AHG的相對表達量分別為9.07±3.60、1.18±0.71，兩者相比P<0.05。對照組食管鱗癌組織、癌旁組織中lncRNA MIR663AHG的相對表達量分別為3.43±3.42、1.31±0.92，兩者相比P>0.05。觀察組與對照組食管鱗癌組織中lncRNA MIR663AHG的相對表達量分別為6.11±3.91、1.06±0.61，兩者相比P<0.05。

2.2 與lncRNA MIR663AHG相關的mRNA 共篩選出16個與lncRNA MIR663AHG顯著相關的mRNA，分別為ZNF503(r=-0.870，P=0.000)、PIK3C2A(r=-0.867，P=0.000)、HCFC2(r=-0.841，P=0.000)、WDR82(r=-0.819，P=0.000)、NDFIP2(r=-0.819，P=0.000)、USP47(r=-0.814，P=0.000)、CYFIP1(r=-0.811，P=0.000)、UBE2B(r=-0.808，P=0.000)、NIPSNAP3A(r=-0.805，P=0.000)、NAT8B(r=0.809，P=0.000)、TMEM132C(r=0.810，P=0.000)、ENDOV(r=0.816，P=0.000)、LOC388210(r=0.821，P=0.000)、KRTAP10-7(r=0.830，P=0.000)、ERVMER34-1(r=0.865，P=0.000)、CDHR5(r=0.879，P=0.000)。

3 討論

隨著分子生物學的不斷發展，從基因水平對食管鱗癌發病機制的研究不斷深入。哈薩克族是我國食管鱗癌高發的民族，目前有研究[6,7]表明哈薩克族與漢族食管鱗癌在基因表達方面存在一定的差異。因此，尋找與哈薩克族食管鱗癌相關的特異基因可能對降低其發病率及病死率具有重要的意義。lncRNA不僅可在多個水平參與基因表達調控[8]，而且可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤中起到重要的作用[9,10]。大量的lncRNA被發現在腫瘤組織與正常組織中差異表達，而且特異的lncRNA可作為腫瘤的預測因子[11,12]。

本研究發現，lncRNA MIR663AHG在食管鱗癌組織及癌旁組織中均有表達，但與正常食管組織相比，lncRNA MIR663AHG在哈薩克族食管鱗癌組織中表達上調，而在漢族食管鱗癌組織中表達無差異，并且其在哈薩克族食管鱗癌組織中的表達量高于漢族。表明lncRNA MIR663AHG可能在哈薩克族食管鱗癌的發生發展中起作用，而與漢族食管鱗癌無關。lncRNA MIR663AHG的高表達可能是哈薩克族食管鱗癌發病率高于漢族的又一個重要的影響因素。lncRNA MIR663AHG在哈薩克族食管鱗癌組織中高表達，可能與哈薩克族食管鱗癌的發生、腫瘤的侵襲、轉移及預后等相關。

lncRNA作為細胞內的重要調控因子，本身不具有編碼蛋白質的功能，但是可以通過調控特定的基因來發揮生物學功能。本研究中，我們利用本課題組前期基因芯片的結果篩選出與lncRNA MIR663AHG相關的mRNA，以期通過對相關mRNA功能的分析來初步分析lncRNA MIR663AHG在食管鱗癌中的生物學作用。本研究共篩選出16個與lncRNA MIR663AHG顯著相關的mRNA。PIK3C2A屬于磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族，可能參與整合素依賴的信號途徑及與細胞增殖、細胞凋亡、致癌轉化等相關的信號途徑。USP47屬于泛素特異性蛋白酶(USPs)家族。目前研究發現，USPs家族中的一些成員在表觀調控與蛋白質的穩定性等方面有一定的作用[13]，但是大多數USPs家族成員的生物學作用卻不為人知。Zhang等[14]研究表明，下調USP47的表達能夠抑制胃癌細胞的生長，USP47可能是胃癌的一個新的癌基因。CYFIP1位于人類15號染色體長臂的11.2區域(15q11.2)，該區域是染色體缺失、重排的活躍區域。CYFIP1基因與抑癌基因p53作用相似，其表達下調與乳腺癌、肺癌、膀胱癌等的發生發展有關，是一個候選的抑癌基因[15]。陳旭[16]研究也表明，CYFIP1在鼻咽癌組織中表達下調，且與鼻咽癌的臨床分型、局部浸潤、遠處轉移有關，提示CYPIF1表達下調可能與鼻咽癌的發生發展有關。其余mRNA在腫瘤中未見相關報道，但在本研究中這些mRNA在哈薩克族食管鱗癌組織中差異表達，其在腫瘤中的作用尚需進一步驗證。目前對于lncRNA MIR663AHG在腫瘤中的作用尚不明確，lncRNA MIR663AHG可能通過與相關基因的相互作用在腫瘤中發揮一定的生物學作用，其在食管鱗癌中的作用尚需進一步探討。可進一步擴大樣本量，探討lncRNA MIR663AHG的表達量與臨床病理參數的相關性，并通過體內外實驗進一步探討其對食管鱗癌生物學作用的影響。

綜上可見，lncRNA MIR663AHG在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中高表達，其可能通過調節相關mRNA參與哈薩克族食管鱗癌的發生發展。

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