蛋白質組學在非小細胞肺癌生物標記和靶向藥物治療中的應用進展

寧德利，金銘，徐濤，孫輯凱，李敏

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

肺癌是目前全球發病率、病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例的85%[2]，其主要的組織學類型為鱗狀細胞癌(SqCC)和腺癌(ADC)[3]。隨著蛋白質組學和腫瘤分子生物學的發展，生物標記及藥物靶向治療成為腫瘤治療的發展方向和有效手段。特別是隨著質譜技術的快速發展，蛋白質組學作為可以對整體蛋白表達進行有效估量的工具[4]，已廣泛應用于發現疾病生物標記和藥物靶向治療，使NSCLC患者有望得到個性化治療。現就蛋白質組學在NSCLC生物標記和靶向藥物治療中的應用進展進行綜述。

1 蛋白質組學在NSCLC生物標記中的應用

1.1 診斷性生物標記 在NSCLC發生發展中，常伴有某些蛋白質的過量表達或抑制表達，通過比較正常樣本及患病樣本在蛋白質種類和豐度上的表達差異，可以確定和篩選特異的NSCLC標記物，將有助于肺癌的早期診斷。

肺癌中一般檢測不到癌胚抗原(CEA)的特異性，其在NCSLC的敏感性只有40%～70%，因此肺癌發展早期臨床診斷的效率低下。近來有學者[5]通過同位素相對標記及絕對定量(iTRAQ)與液相-串聯質譜分析技術，對凝集素親和層析富集的NCSLC患者血清進行研究，發現糖蛋白AACT在NSCLC早期階段表達量降低。此外，還發現GlcNAc糖基化的AACT可作為NCSLC早期診斷的標記物。Marien等[6]采用基于質譜的磷酸脂質組學鳥槍法和雙向脂類組學圖譜分析技術，對NSCLC和與其配對的正常肺組織樣本磷脂數據進行研究。結果發現，其中鞘磷脂(SMs)表達量顯著降低，而特定磷脂酰肌醇(PI)顯著升高。這些脂類標記能夠說明NSCLC或其亞型存在，此種方法將成為NSCLC的有效診斷工具。

鈣網蛋白(CANX)在血清中的表達水平對NSCLC的疾病進程具有重要意義。Kobayashi等[7]采用聯合免疫沉淀反應、基質輔助激光解析離子化-飛行時間-質譜技術(MALDI-TOF-MS)和反相蛋白陣列技術，分析肺癌患者和正常對照的血清樣本。結果發現，CANX水平在肺癌第一階段就上調表達，并且隨著病情的加重，CANX表達水平顯著升高。因此，血清CANX水平可作為早期肺癌檢測標記。

Liu等[8]采用深度非標記定量蛋白質組學技術，對胸腔積液樣本進行研究。發現NSCLC患者的肝細胞生長因子受體(MET)、二肽基肽酶4(DPP4)和蛋白酪氨酸磷酸酶受體F(PTPRF)的蛋白水平表達顯著高于良性對照組。該研究表明，用這種方法建立一個新的胸腔積液蛋白質組的數據庫，有利于從良性腫瘤中鑒定出NSCLC的治療靶點。

蛋白糖基化在癌細胞生長、分化和遷移過程中發揮著重要的調節作用。Yang等[9]對NSCLC的兩個亞型ADC和SqCC做了糖基化蛋白和總蛋白的組學分析，發現中性粒細胞彈性蛋白酶(ELANE)和類胰島素生長因子結合蛋白3(IGFBP3)兩個糖基化蛋白在SqCC中高度表達，而聚集蛋白多糖(ACAN)、層粘連蛋白亞基γ-2(LAMC2)、凝血栓蛋白1(THBS1)、生長因子β1結合蛋白1(LTBP1)、鞘脂激活蛋白(PSAP)和膠原蛋白Ⅰ型α2(COL1A2)在ADC中高度表達。此外，通過信號網絡分析軟件可以鑒定NSCLC致病相關蛋白的上游調控因子。

吸煙者患肺癌的比例是不吸煙者的15～30倍。Rice等[10]應用同位素相對標記相對與絕對定量技術，對吸煙者和不吸煙者的血漿樣本進行研究，發現吸煙者血漿樣本中的載脂蛋白E(Apo E)表達水平顯著高于不吸煙者。此外還發現，鱗狀轉移瘤惡化前Apo E在血漿和組織中表達有著重要的聯系。Apo E的表達水平是一種新的鱗狀轉移瘤早期形態變化的診斷生物標記物。

1.2 預測性生物標記 蛋白質組學的發展為肺癌治療新靶點的鑒定帶來了新的變革。Xiao等[11]利用鏈親和素瓊脂糖Pulldown實驗及蛋白質組學分析鑒定，確認Ku80(參與修復破碎DNA雙鏈的Ku二聚體)是一種作為環氧化酶-2(COX-2)基因啟動子的新型結合蛋白，轉錄輔激活子CRED結合蛋白(CBP)的過表達可以增加Ku80乙酰化作用，從而促進COX-2表達和腫瘤的生長，提示Ku80是肺癌發生和發展的一個潛在的治療靶點。Xu等[12]采用基于細胞同位素標記的定量蛋白質組學技術，鑒定經紫杉醇處理的細胞蛋白質豐度變化，發現程序性細胞死亡因子4(PDCD4)表達下調，肺癌組織中的PDCD4高水平表達與接受紫杉醇治療的肺癌患者生存時間呈正相關，表明PDCD4為潛在的肺癌患者抵抗紫杉醇的預測標記。

納米顆粒載藥化療法可以提高藥物輸送效果和減少毒性。為了更好地了解耐藥細胞對納米顆粒治療法的響應，Zhao等[13]利用定量蛋白質組學的方法，研究白蛋白結合型納米顆粒紫杉醇治療NSCLC細胞的蛋白質表達情況，發現環指蛋白139(RNF139)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1(HMGCS1)在脂質代謝過程中過表達，與白蛋白結合型納米顆粒紫杉醇抗性相關，表明這些蛋白質可能是預測納米顆粒治療NSCLC抗性的生物標記物。此外，Walker等[14]利用一個八通道同位素標簽串聯質譜的蛋白質組學技術，檢測患者在放療前和放療中的血漿樣本。結果發現，放射治療1周后的C反應蛋白(CRP)和富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG1)在生命延長的群體樣本中有顯著變化，為進一步決策NSCLC患者是否接受放射治療提供實驗依據。

為能夠接受靶向治療的患者找到預測標志物，是制定有效治療方案的必要因素。事實上，Cho[15]在比較NSCLC細胞的抗藥性和敏感性時發現，蛋白翻譯后磷酸化變化明顯比轉錄水平的劇烈。提示蛋白表達和翻譯后修飾可為靶向藥物治療患者的潛在標記提供依據。

1.3 預后性生物標記 針對癌癥患者選擇不同方案的治療結果，預后標記可作為識別和分析的一個重要工具。Wang等[16]利用基于SILAC的定量蛋白質組學結合免疫沉淀技術，對侵襲肺ADC的特異核轉運蛋白(KPNA2)蛋白復合體進行研究，發現與早期相比，晚期的ADC組織中KPNA2-波形蛋白-磷酸化的細胞外信號調節激酶(Erk)復合體水平顯著升高，表明KPNA2的過表達與癌癥侵襲和細胞遷移相關，進而表明KPNA2水平的檢測可能是一個潛在的ADC的預后標記。Xu等[17]通過基質輔助激光解析離子化-質譜技術(MALDI-MS)，對NSCLC切割組織進行研究，發現Ⅰ期NSCLC的不良預后也與波形蛋白和非肌球蛋白陽性表達相關，波形蛋白和非肌球蛋白過表達可作為判斷細胞轉移和惡性腫瘤復發的標志。

還有研究表明，血清中CRP和血清淀粉樣蛋白A(SAA)水平的升高也可作為肺癌的預后標記。Zhang等[18]運用差異蛋白質組學方法分析確定，在肺癌患者的血清樣本中存在著CRP結合SAA(CRP-SAA)蛋白體。與健康對照相比，低存活率患者中CRP-SAA蛋白水平顯著升高。此外，單變量和多變量Cox分析表明，CRP-SAA可以作為一個獨立的早期肺癌患者的預后標志。

2 蛋白質組學在NSCLC靶向藥物治療中的應用

靶向藥物治療是NSCLC的一個重要的治療手段。然而，需要根據不同患者不同分子病理情況來選擇各種敏感性和耐藥性的靶向治療方案，且藥物作用機制多與信號通路相關。

2.1 表皮生長因子受體(EGFR)為靶向的藥物治療 對于治療EGFR突變的NSCLC，酪氨酸激酶抑制劑(TKI)已經成為一種很有前景的選擇。然而，許多患者都是從最初對EGFR-TKI產生反應，到最后產生了抗藥性。Koch等[19]運用激酶親和純化與質譜定量的化學蛋白質組學方法，發現在EGFR突變的NSCLC細胞中，促紅素人肝細胞受體酪氨酸激酶A2(EPHA2)表達水平高于對照的10倍以上。此外，敲除EPHA2能夠降低局部粘著斑激酶(FAK)磷酸化和細胞遷移。這表明，EPHA2的過表達與NSCLC的EGFR-TKI抗藥性相關，是產生EGFR-TKI耐藥性NSCLC患者的潛在藥物靶點。盡管如此，仍有30%的患者耐藥機制不清，Wang等[20]利用定量的磷酸蛋白質組學及蛋白質組學的技術，對吉非替尼處理過的敏感和非敏感NSCLC細胞進行比較，在綜合鑒定的1 548個磷酸化蛋白和3 834個蛋白中，發現以CK2為核心的信號網絡與吉非替尼抗性相關。

和吉非替尼一樣，厄洛替尼也是常用的TKI，對NSCLC患者有很好的療效。Bosse等[21]通過細胞培養條件下穩定同位素標記技術，對厄洛替尼敏感和非敏感NSCLC細胞株進行蛋白定量分析，在900多個變化蛋白中，發現組織型纖溶酶原激活蛋白(tPA)、EGFR、尿基型纖溶酶原激活蛋白(uPA)、血小板源生長因子D(PDGF-D)和骨髓源生長因子(MYDGF)呈現顯著變化，其中tPA在厄洛替尼非敏感NSCLC細胞株中過表達，并證明了有14種蛋白質與tPA相互作用，對NSCLC細胞厄洛替尼耐藥性的機制有了進一步的闡釋。

Pan等[22]在用伊諾肝素和吉非替尼處理NSCLC細胞的愈傷及細胞遷移的實驗中，采用了凝膠電泳和液質聯用技術進行分析。結果發現，胞質分裂作用因子1(DOCK1)和細胞骨架中間絲波形蛋白的表達，在細胞遷移過程中發揮重要作用。綜合蛋白質組學和通路分析顯示，DOCK1表達和波形蛋白磷酸化可以作為預測吉非替尼對NSCLC作用的潛在標記物。可以通過伊諾肝素判斷出吉非替尼抑制腫瘤和細胞遷移的活性，主要是通過抑制DOCK1表達和波形蛋白磷酸化實現的。

2.2 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑為靶向的藥物治療 雷帕霉素是目前應用最為廣泛的一種mTOR抑制劑，通過調控信號通路阻斷細胞周期、促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤血管生成，達到抗腫瘤的作用。但從長期療效來看，雷帕霉素的利用率低，穩定性差。Fan等[23]利用iTRAQ標記蛋白質組學技術，對白藜蘆醇衍生物(TMS)處理過的H1975細胞和正常細胞進行總蛋白比較分析，發現78個蛋白表達上調，75個蛋白表達下調。而其中有22個蛋白與mTOR信號通路及下游核糖體生物合成相關。經TMS處理的H1975細胞中，CaMKKβ-AMPK-mTOR通路的重要蛋白AKT、mTOR、P70S6K和S63豐度顯著下調，表明TMS具用抑制mTOR的作用，但仍需更多的臨床試驗進一步驗證。

2.3 其他信號傳導途徑為靶向的藥物治療 盡管EGFR抑制劑的靶向治療已經應用于臨床實踐中，但對于吸煙引起的癌癥患者沒有明顯的治療效果。因此，通過研究香煙煙霧誘發信號機制找到替代藥物的靶點，成了迫切需要解決的問題。通過細胞培養條件下穩定同位素標記及親和富集磷酸化肽段技術，鑒定暴露在香煙煙霧中異常表達的磷酸化肽段，發現煙霧中H358細胞有278個磷酸位點過度表達，其中包括p21相關激酶6(PAK6)和EGFR。PAKs作為Rho GTPase蛋白的下游效應因子，參與多種重要的細胞生命活動，如細胞增殖、細胞運動和轉錄激活等[24]，而在前列腺癌、乳腺癌和肝細胞癌中，PAK6都呈現過度表達[25]。表明PAK6可能作為治療NSCLC特別是吸煙患癌者的潛在靶標[26]。

Flores-Pérez等[27]在驗證沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)是否可以與順鉑產生協同效應時，采用雙向凝膠電泳和電噴霧電離—多級質譜技術，對NSCLC細胞的調控蛋白進行鑒別，發現肝癌衍生生長因子(HDGF)受到EGCG的抑制作用，呈現3倍以上的下調表達現象。這種通過EGCG減少HDGF表達的方法，能提高化療所致的細胞凋亡率，從而使NSCLC細胞對順鉑治療更加敏感，因此可以利用EGCG降低HDGF的水平，進而作為順鉑治療NSCLC患者的一個新的治療靶點。

蟾毒靈(CS-6)是蟾酥中重要的蟾二烯羥酸內酯，在癌癥治療過程中具有代謝穩定和副作用小的特點，又能讓NSCLC的A549細胞阻滯在G2/M期和凋亡。Zhang等[28]利用定量蛋白質組學技術發現了38個CS-6作用的潛在靶點蛋白，其中31個是網絡互作蛋白，1個是重要的節點蛋白熱激蛋白90(HSP90)。CS-6通過與HSP90結合的ATP相互作用，抑制HSP90分子伴侶的功能，進而降低HSP90相關蛋白的表達。表明CS-6可有效抑制腫瘤生長，為NSCLC的臨床治療提供了實驗證據。

另外，幾種周期蛋白依賴性激酶4/6(CDK4/6)抑制劑應用于臨床實驗治療NSCLC。Sumi等[29]運用無偏差質譜化學蛋白質組學方法，對帕博西尼和瑞博西尼處理的肺鱗癌組織進行分析，發現CDK9是除CDK4/6外的另一個藥物治療靶點。此外，帕博西尼還特異與幾種脂質激酶相互作用，其中酪蛋白激酶2和磷酸肌醇3激酶調配亞基4調控細胞凋亡，而PI-3激酶催化亞基δ和PI-5-磷酸鹽-4激酶2型A/B/C則與AKT信號傳導相關。表明帕博西尼作為脂質激酶抑制劑，通過調控PI3K/AKT信號途徑促進癌細胞凋亡。

蛋白質組對研究人類NSCLC精準腫瘤學很重要。盡管最近利用蛋白質組學技術鑒定了許多NSCLC潛在的治療靶點，但在臨床應用上還很少，因此，如何縮短蛋白質組學結果與臨床應用的差距至關重要。僅研究蛋白標記的差異表達對臨床應用來說是遠遠不夠的。要在綜合多種組學方法的基礎上，構建人體組織蛋白質組圖譜，從而得到蛋白質的空間定位，直至單細胞水平[30]。定位人體全蛋白質組的人類蛋白質組計劃，將為研究人員提供豐富的肽段和蛋白數據庫，為診斷、預后、治療和預防醫學應用提供便利，也將為NSCLC的靶向治療提供發展平臺。

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